Nanočestica usmjerena na bubrege za povećanje bubrežne limfne gustine smanjuje krvni tlak kod hipertenzivnih miševa
Nov 10, 2023
sažetak:Hronična intersticijska upalai bubrežna infiltracija aktiviranih imunih ćelija igraju integralnu ulogu u hipertenziji. Limfati regulišu upalu putemklirens imunih ćelijai višak intersticijske tečnosti. Prethodno smo demonstriralipovećanje bubrežne limfangiogenezesprečava hipertenziju kod miševa. Pretpostavili smo da će ciljana nanočestica isporuka vaskularnog endotelnog faktora rasta-C (VEGF-C) u bubreg inducirati bubrežnu limfangiogenezu, snižavajući krvni tlak kod hipertenzivnih miševa. Nanočestica koja cilja na bubrege je napunjena VEGF receptor-3-specifičnim oblikom VEGF-C i ubrizgana je miševima sa hipertenzijom izazvanom angiotenzinom II ili hipertenzijom izazvanom LNAME svaka 3 dana. Miševi tretirani nanočesticama pokazali su povećanu gustinu i širinu renalnih limfnih sudova u poređenju sa hipertenzivnim miševima kojima je ubrizgan samo VEGF-C. Miševi tretirani nanočesticama pokazali su sniženi sistolni krvni tlak, smanjenproinflamatorne imune ćelije bubregai povećano frakciono izlučivanje natrijuma u urinu. Naši nalazi pokazuju da farmakološki proširena renalna limfatika smanjuje krvni tlak i povezana je s povoljnim promjenama ububrežne imune ćelijeipovećano izlučivanje natrijuma.
Ključne riječi:bubreg; limfni putevi;upala; imunitet; hipertenzija
NABAVITE BILJNU FORMULACIJU CISTANCHE ZA BUBREGE
1. Uvod
Gotovo 1 od 2 odrasle osobe u SAD-u ima hipertenziju, a ona je nekontrolirana kod mnogih pacijenata [1]. Unatoč poboljšanoj edukaciji, naporima javnog zdravlja i propisanim lijekovima, oko 30-60% hipertoničara ne može postići idealan krvni tlak. Ovo je žalosno jer smanjenje sistoličkog krvnog tlaka od čak 10 mmHg značajno smanjuje zdravstvene rizike i poboljšava ishode [2]. Potrebne su dodatne mogućnosti liječenja kako bi se pomoglo ovoj hipertenzivnoj populaciji da smanji krvni tlak, idealno u normotenzivnom rasponu.
Infiltracija bubrežnih imunoloških stanica, upala i retencija natrijuma snažno su povezani s hipertenzijom [3-5]. Limfni sudovi transportuju tečnost, elektrolite, ćelije i proteine iz intersticijalnog prostora do drenažnog limfnog čvora, a zatim nazad u cirkulaciju [6,7]. Limfangiogeneza povezana s upalom opažena je kod akutne ozljede bubrega i kodhronične upalne bolestikao što sudijabetička nefropatijaikarcinom bubrega[8]. U aninflamatorno stanje, povećanje limfe pokušava da pomogne u uklanjanju imunih ćelija, proteina i tečnosti iz organa. Ranije smo izvijestili da se limfangiogeneza također javlja u bubrezima kao kompenzacijski odgovor u različitim modelima hipertenzije [9-11]. Međutim, ovo kompenzatorno povećanje bubrežne limfe nije bilo dovoljno da se riješi upale i hipertenzije. Genetski indukovana limfangiogeneza specifična za bubrege kod miševa spriječila je razvoj hipertenzije osjetljive na sol, hipertenzije izazvane inhibicijom dušikovog oksida (L-NAME) (LHTN) i hipertenzije izazvane angiotenzinom II (A2HTN), a to je bilo povezano sa smanjenjem akumulacija bubrežnih imunoloških ćelija i povećano izlučivanje natrijuma [9,11,12]. Pored toga, genetska indukcija limfangiogeneze specifične za bubrege kod miševa je oslabila postojeći LHTN, a to je bilo praćeno povećanjem izlučivanja natrijuma [12].
Ovdje smo željeli razviti potencijalni translacijski terapeut koji bi posebno ciljao bubrege i promovirao limfangiogenezu za smanjenje krvnog tlaka u hipertenzivnim stanjima. Koristili smo tehnologiju nanočestica za isporuku faktora rasta specifičnog za limfe na osnovu prethodnih izvještaja o nanočesticama koje ciljaju bubrege [13–15]. Postoje i drugi sistemi za isporuku lijekova koji koriste nanočestice, a svi su namijenjeni poboljšanju efikasnosti, specifičnosti i biodostupnosti. Nanočestice mogu biti dizajnirane da pokažu jedinstvena fizikalno-hemijska svojstva kao što su veličina (50~200 nm), oblik i kemija površine i mogu biti opremljene da nose jedan ili više dijagnostičkih i/ili terapeutskih agenasa, oslobađajući ih putem vanjskih pokretača kao što je temperatura , pH i enzimi. Takođe, inkapsulacija tih terapeutskih ili dijagnostičkih agenasa u nanočestice omogućava im da produže svoj sistemski poluživot i na taj način mogu biti značajno lokalizovani na ciljanom području. Trenutno postoje različite nanočestice uključujući micele, liposome, nanosfere, nanocijevi, nanokapsule, kubosome i hidrogelove na osnovu njihove morfologije. Ovdje smo testirali nanočestice micela i liposoma kako bismo utvrdili koja je učinkovitija.
Naša hipoteza je bila da nanočestica ciljana na bubrege isporučuje pro-limfangiogeni faktor rasta, receptor vaskularnog endotelnog faktora rasta-3 (VEGFR-3)-specifičnu izoformu vaskularnog endotelnog faktora rasta C (VEGF-C) , povećao bi renalnu limfnu gustoću i smanjio krvni tlak kod mužjaka i ženki miševa s A2HTN ili LHTN. Također smo pretpostavili da će smanjenje krvnog tlaka biti povezano sa smanjenjem pro-upalnih imunoloških stanica bubrega, povećanjem protuupalnih bubrežnih imunoloških stanica i povećanim izlučivanjem natrija. Zbog dugog trajanja izazivanja hipertenzije osjetljive na sol i ograničenog broja injekcija repne vene kod miševa, ovaj model nije korišten u trenutnoj studiji.
2. Materijali i metode
2.1. Razvoj i karakterizacija nanočestica
PLGA-PEG-folat blok kopolimer je kupljen od PolySciTech (West Lafayette, IN, SAD), a Certifikat o analizi koji pokazuje NMR, FTIR analizu i GPC može se vidjeti na slici S1. Korištenjem 50 mg PLGA-PEG-folatnog blok kopolimera, 10 mg boje Kumarin 6, 10 mg FITC-ovalbumina ili 1 mg VEGF-C je inkapsulirano u nanočestice metodom dijalize kako bi se napravile micele nanočestica 1 (NP1). Konkretno, lijek i polimer su rastvoreni u dimetil sulfoksidu (DMSO), a rastvor je prebačen u membranu za dijalizu (MWCO 100,000). Dijaliza je provedena 24 h protiv DI vode. Nakon toga, vodeni rastvor čestica je centrifugiran i sonikiran da bi se čestice koncentrirale. Za izradu liposomalne nanočestice koristili smo nekoliko lipidnih komponenti uključujući DSPC (120 mg), holesterol (16 mg), DSPE-PEG-folat (24 mg) i Kumarin 6 boju (10 mg) ili FITC-ovalbumin (10 mg) . Prvo, sve gore navedene komponente su rastvorene u DCM (10 mL), a zatim je DCM uklonjen protokom vazduha da bi se napravio tanak film na površini staklenih bočica. Zatim je u tanki film dodano 10 mL PBS-a da bi se napravila liposomska nanočestica 2 (NP2). Veličina nanočestica određena je dinamičkim raspršivanjem svjetlosti (DLS) korištenjem Zetasizer-a (Malvern Panalytical, Malvern, UK). Koncentracija uzorka je održavana na 0,5 mg/mL. Količina inkapsulacije boje Kumarin 6 izvedena je iz mjerenja apsorbancije otapanjem 100 µL nanočestica u 900 µL DMSO, koji je oslobodio Kumarin 6 u otopinu DMSO.
Apsorpcija je zatim izmjerena na 444 nm. Koristeći unaprijed izmjerenu kalibracijsku krivu apsorbancije kumarina 6 prema njegovoj titriranoj koncentraciji, izračunata je inkapsulirana koncentracija kumarina 6 (NP1: 5 ± 0.35 mg i NP2: 4 ± {{10 }}.89 mg za kumarin 6). Korištenjem unaprijed izmjerene kalibracione krive apsorpcije FITC-ovalbumina prema njegovoj titriranoj koncentraciji, izračunata je koncentracija inkapsuliranog FITC-ovalbumina (4 ± 0,51 mg). Količina inkapsulacije VEGF-C unutar NP određena je ELISA testom i iznosila je ~500 ± 17 µg. Svi NP su obloženi folatima koji ih ciljaju na proksimalne tubule bubrega, s obzirom na visoku ekspresiju folatnih receptora. Šematski prikaz NP sklopa može se vidjeti na slici S2
Profili otpuštanja kumarina 6 ili FITC-ovalbumina proučavani su metodom dijalize sa membranskom cijevi. Jedan mL rastvora nanočestica je dodat u epruvetu za dijalizu (Cutoff MW 3500) i zatim uronjen u 10 mL PBS-a koji sadrži 0,5% v/v Tween 80 rastvora. U datom trenutku prikupljeni su i zamijenjeni mediji. Intenzitet fluorescencije sakupljenih uzoraka mjeren je na Ex/Em=444/500 nm (Coumarin 6) ili Ex/Em=488/530 nm za FITC-ovalbumin pomoću čitača mikroploča. Kumulativno otpuštanje % kumarina 6 i FITC-ovalbumina iz nanočestica folata može se vidjeti na slici S3.
Za ispitivanje transmisijske elektronske mikroskopije (TEM, JEOL JEM-2010, Japan), suspenzije uzoraka su bačene na bakarnu rešetku obloženu ugljenikom i sušene u vakuumskim uslovima. Mreža je zatim posmatrana pod JEOL transmisionim elektronskim mikroskopom pri ubrzavajućem naponu od 200 kV. Da bi se odredila in vivo biodistribucija, 100 µL svakog NP1 (10 mg/mL) ili NP2 (10 mg/mL) je ubrizgano u ženke C57BL/6J miševa (n=3) kroz repnu venu. Signali fluorescencije Kumarina 6 su zabilježeni na Ex/Em=444/500 nm. Dvanaest sati nakon injekcije, životinje su eutanazirane i svaki organ je uzet. Uzeti organi su skenirani pod In Vivo FX Pro skenerom kako bi se kvantifikovala distribucija NP. Sve procedure izvedene na miševima odobrene su od strane Texas A&M University IACUC u skladu sa NIH Vodičem za njegu i korištenje laboratorijskih životinja.
2.2. Miševi
Divlji tip C57BL/6J miševi su kupljeni od Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, SAD). Mužjaci i ženke miševa starosti 10–14 sedmica hirurški su implantirani pod anestezijom inhalacionog izoflurana (1,5–5%) sa osmotskim mini pumpama (Alzet, model 1004, Cupertino, Kalifornija, SAD) koje sadrže angiotenzin II (490 ng/kg/min; BACHEM, Torrance, Kalifornija, SAD) (A2HTN), a zatim topikalni lidokain. Drugoj grupi mužjaka i ženki miševa dato je L-NAME (Sigma, St. Louis, MO, SAD) u vodi za piće (0,5 mg/mL) tokom trajanja eksperimenta (LHTN). Nakon 2 dana, hipertenzija je potvrđena preko repnog krvnog pritiska u svim grupama. Miševi su zatim randomizirani i ubrizgani u repnu venu ili micelarnom nanočesticom napunjenom VEGFR-3-specifičnim mutantom VEGF-C (VEGF C c156s) [16] ili samim slobodnim VEGF-C proteinom svaka 3 dana tokom tok od 16 dana (ukupno 4 injekcije u repnu venu). Ovaj raspored injekcija je modeliran prema prethodnom radu [17] i omogućio je dovoljno vremena za vaskularno remodeliranje na nivou dovoljnom da utiče na krvni pritisak. Dodatno, 3-dnevni period odmora produžio je život krhkih mišjih repnih vena dok je pro-limfangiogeni signal ostao dosljedan. Čak i uz period oporavka, repne vene su mogle podnijeti samo 5 injekcija prije nego što su pretrpjele nepovratno oštećenje. Svi miševi su žrtvovani 16 dana nakon početne injekcije. Miševi su eutanazirani perfuzijom tkiva pod dubokom anestezijom izofluranom, a zatim cervikalnim dislokacijom prije prikupljanja tkiva. Sve procedure izvedene na miševima odobrene su od strane Texas A&M University IACUC u skladu sa NIH Vodičem za njegu i korištenje laboratorijskih životinja.
2.3. Krvni pritisak
Očitavanja sistolnog krvnog pritiska (SBP) su uzeta u različitim vremenskim tačkama preko repne manžetne. Za sva mjerenja korišten je IITC Life Science neinvazivni sistem za mjerenje krvnog pritiska za miševe (IITC Inc., Woodland Hills, Kalifornija, SAD). Krvni pritisak je izmjeren nakon 30-min aklimatizacijskog perioda u određenom mirnom području. Za to vrijeme, komora za zagrijavanje i komore za zadržavanje su ostavljene da se zagriju na 34 ◦C. Miševi su lagano stavljeni u komore za zadržavanje odgovarajuće veličine i ostavljeni da se aklimatiziraju u komori za zagrijavanje 5 minuta prije mjerenja SBP-a. Mjerenja SBP-a izvedena su iz praćenja pritiska od strane dva nezavisna, zaslijepljena istraživača.
2.4. Sakupljanje i mjerenje seruma i urina
Sakupljanje i mjerenje seruma i urina: Miševi su smješteni u metaboličke kaveze (Hatteras, Cary, NC, USA) i ostavljeni da se aklimatiziraju preko noći. Nakon aklimatizacije, urin je prikupljan 24 h, zaključno sa eutanazijom. Izmjeren je prikupljeni urin. Krv je pri eutanaziji sakupljena preko lijeve komore, a serum je izolovan za kasnije mjere. Serum i urin su analizirani kapilarnom elektroforezom na natrijum korišćenjem DxC 700 AU hemijskog analizatora (Beckman Coulter, Brea, Kalifornija, SAD) i direktnom potenciometrijom za kreatinin korišćenjem sistema za kapilarnu elektroforezu P/ACE MDQ Plus (Sciex, Redwood City, , SAD). Ove mjere su korištene za izračunavanje izlučivanja urina, frakcijske ekskrecije natrijuma (FENa) i klirensa kreatinina.
2.5. Imunofluorescencija
Prilikom eutanaze, bubrezi su sakupljeni, sagitalno isječeni na polovine i fiksirani u 10% puferiranom rastvoru formalina (Sigma, St. Louis, MO, SAD) tokom 48 h. Nakon fiksacije, polovice bubrega su isprane u 100% etanolu i stavljene u parafin. Polovine bubrega su izrezane na dijelove od 5-7 µm, koji su deparafinizirani, rehidrirani i permeabilizirani 0,1% otopinom Tritona (BioRad, Hercules, Kalifornija, SAD). Tkivo je blokirano 10% otopinom AquaBlock (EastCoastBio, North Berwick, ME, SAD) prije nego što je imuno označeno markerima limfnih endotelnih stanica LYVE-1 ili podoplaninom (kozji poliklonski; R&D Systems, Minneapolis, MN, SAD) preko noći inkubacija na 4 ◦C. Alexafluor 488 ili 594 (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornija, SAD) sekundarna antitijela su korištena za vizualizaciju limfnih sudova. Uzorci su inkubirani sa odgovarajućim konjugiranim sekundarnim antitelima jedan sat na sobnoj temperaturi. Negativne kontrole su inkubirane samo sa sekundarnim antitelom. Svi označeni dijapozitivi su montirani ProLong Gold reagensom protiv bledenja koji sadrži DAPI (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, SAD). Za snimanje je korišćen Olympus BX51 fluorescentni mikroskopski sistem sa Olympus Q5 kamerom. Slike su snimljene pri uvećanju od 40x pomoću softvera za snimanje Olympus CellSens (Olympus, Shinjuku, Tokio, Japan). Iste metode su korištene za snimanje limfnih čvorova u srcu, jetri, plućima i koži (uvećanje od 10× ili 20×).
2.6. Renal Immunofluorescence
Kvantifikacija Iz svakog odjeljka bubrega, 5-7 slika je prikupljeno 20× iz unaprijed određenih područja, općenito izbjegavajući defekte tkiva, manje čašice i veliki broj glomerula. ImageJ je korišten za prikupljanje vrijednosti površine koje mjere ukupan broj podoplanin+ piksela nakon što je postavljen prag za pozitivan endotel.
2.7. Kvantifikacija maksimalne širine renalnih limfnih sudova
Iz svakog odjeljka bubrega prikupljene su slike svih limfnih žila povezanih s arterijama unutar korteksa pri 20×. Limfni sudovi su identifikovani prisustvom bojenja podoplaninom. ImageJ je korišten za prikupljanje dužine u pikselima najšire tačke svih limfnih sudova koji sadrže lumen.
2.8. Protočna citometrija
Pri eutanaziji su sakupljeni bubrezi, a kapsule su izvađene. Tkivo je temeljito usitnjeno i digestirano u puferu koji sadrži kolagenazu D (2,5 mg/mL, Roche Sigma, St. Louis, MO, SAD) i Dispase II (1 mg/mL, Sigma) na 37 ◦C tokom 1 h. Digestivni uzorci su filtrirani i isprani kroz cjedila od 100 i 40 µm. Protok je centrifugiran da se izoluju ćelijske komponente, a crvena krvna zrnca su lizirana u NH4Cl/EDTA. Splenociti su izolovani na sličan način za upotrebu kao kontrola antitijela i za provjeru veličine i oblika imunih ćelija prema naprijed u odnosu na bočno. Bubrežne ćelije su resuspendovane u 0,1% rastvoru FBS. Da bi se spriječilo nespecifično Fc vezivanje, uzorci su inkubirani sa anti-mišjim CD16/CD32 antitelom (BD Pharmingen, San Jose, CA, SAD) 10 minuta na ledu. Ćelije su zatim inkubirane sa fluorescentno konjugovanim antitelima protiv CD45, F4/80, CD11c i CD3e i filtrirane kroz drugu sterilnu cediljku od 40 µm. Sva antitijela su kupljena od BD Biosciences. Pogledajte Tabelu S1 na mreži za deskriptivni panel. Za akviziciju je korišten BD LSR Fortessa X-20 protočni citometar sa softverom FACS DIVA (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Populacije od do 500,000 ćelija su analizirane pomoću FlowJo v10.6.2.1 (FlowJo, LLC, Ashland, OR, SAD). CD3e+ populacije su kvantificirane unutar CD45+ kapije. CD3e PacBlue+ populacije su bile negativne na fluorofore PE i PerCP-Cy5.5. Populacije F4/80+ i CD11c+ su kvantificirane unutar CD45+/CD3egate-a (Slika S4). Ove populacije su bile negativne na PacBlue, APC i APC-Cy7 fluorofore. Rezultati su izraženi kao postotak ukupnih CD45+ ćelija po bubregu. Strategija gatinga se može naći na slici S4. Informacije o antitijelima nalaze se u Tabeli S1.
2.9. Statistika
Rezultati su predstavljeni u obliku tačaka i srednje vrijednosti ili srednje vrijednosti ± SEM. Razlike između 2 grupe su procijenjene pomoću 2-repa neparnog Studentovog t-testa i između 3 ili više grupa sa jednosmjernom ANOVA-om praćenom Student-Newman-Keulsovim post hoc testom. Nivo značajnosti je postavljen na 0.05 za sva poređenja. Sve statističke analize su obavljene korišćenjem softvera SigmaPlot 10 (Systat, San Jose, CA, USA).
Wecistanche usluga podrške - najveći izvoznik cistanchea u Kini:
Email:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel:+86 15292862950
Kupite za više detalja o specifikacijama:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
