Izrazita distribucija faktora koji izaziva hipoksiju-1 u kultiviranim bubrežnim tubularnim stanicama sa hipoperfuzijom simuliranom postavljanjem pokrovnog slip-a

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Tomoko Honda¹| Yosuke Hirakawa¹ | Kiichi Mizukami²| Toshitada Yoshihara²| Tetsuhiro Tanaka¹| Seiji Tobita²| Masaomi Nangaku

Abstract

Hronična hipoksija u bubrežnom tubulointersticiju igra ključnu ulogu u napredovanju hroničnebubregbolest(CKD). Stoga je važno istražiti tubularnu hipoksiju i aktivnost faktora koji izaziva hipoksiju (HIF)-1 kao odgovor na hipoksiju. Razrjeđivanje peritubularne kapilare uzrokuje hipoperfuziju u CKD; međutim, efekat hipoperfuzije na HIF je retko istražen. Izazvali smo hipoperfuziju uzrokovanu stavljanjem pokrovnog stakala kod čovjekabubreg-2 ćelija i uočili gradijent kiseonika ispod pokrovnog stakala. Imunocitohemija HIF-1 pokazala je formaciju u obliku krofne na rubu pimonidazol-pozitivnog područja, koju smo nazvali "HIF-prsten". Tenzija kiseonika u HIF-prstenu je procenjena na između približno 4 mmHg i 20 mmHg. Ovaj rezultat nije bio kompatibilan sa rezultatima prošlih istraživanja koja su pokazala akumulaciju HIF-1 u anoksičnom opsegu sa homogenom tenzijom kiseonika. Dalje smo uočili prisustvo pH gradijenta ispod pokrovnog stakala, kao i pomak HIF prstena zbog promjena u pH medijuma kulture, što sugerira da je HIF prsten formiran supresijom HIF-1 povezanog do niskog pH. Ovo istraživanje je pokazalo da aktivacija HIF{10}} oponaša fiziološko stanje u kultivisanim ćelijama sa hipoperfuzijom.

KLJUČNE RIJEČIhipoperfuzija, hipoksija, faktor izazvan hipoksijom, gradijent kiseonika, pH

Cistanche herbasprečava bolest bubrega, kliknite ovdje za uzorak

1|UVOD

Incidencija hroničnihbubregbolest(CKD) raste širom svijeta kako društva stare (Tonelli & Riella, 2014). Progresija CKD-a je ireverzibilna kada oštećenje bubrega dostigne određeni stepen i konačno rezultira završnom bubrežnom bolešću (ESRD), bez obzira na osnovnu bolest. Ovaj ishod ukazuje na postojanje "konačnog zajedničkog puta". Prema dosadašnjim patološkim analizama, pad bubrežne funkcije je snažnije koreliran s tubulointersticijskim oštećenjem nego s oštećenjem glomerula. Bilo je nekoliko izvještaja koji pokazuju da renalna fibroza izaziva kroničnu hipoksiju u tubulointersticijumu, a ova tubulointersticijska hipoksija pogoršava CKD i dovodi do ESRD. Ovi dokazi ukazuju na to da tubulointersticijska hipoksija igra ulogu u konačnom zajedničkom putu CKD (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Thebubregje vrlo osjetljiv na hipoksiju zbog velike potražnje za kisikom i postojanja šanta za kisik između intrarenalnih arterija i vena (Nangaku, 2006; Welch et al., 2001; Zhang et al., 2014). Stoga smatramo da je neophodno istražiti hipoksiju i odgovor na hipoksiju u bubrežnom tubulointersticiju.

Primarni biološki odgovor na hipoksiju u živim organizmima javlja se putem faktora koji izaziva hipoksiju (HIF) (Hypoxia, 2011; Semenza & Wang, 1992; Zhou et al., 2003). HIF se sastoji od - i - podjedinica. Iako je -podjedinica konstitutivno aktivna, -podjedinica se razgrađuje u prisustvu kiseonika. U normoksičnim uslovima, HIF- je hidroksiliran domenom prolil hidroksilaze (Ph.D.), što ga čini prepoznatljivim po von Hippel-Lindau tumor supresoru (VHL). Ovo prepoznavanje rezultira ubikvitinacijom i degradacijom hidroksiliranog HIF-a u proteazomu. U hipoksičnim uslovima, HIF- se akumulira u citosolu, jer nehidroksilovani HIF- izbegava degradaciju. Akumulirani HIF- se prenosi iz citosola u jezgro, gdje dimerizira sa HIF- , i djeluje kao transkripcijski faktor, promovišući ekspresiju nizvodnih gena. Od tri identificirana izoforma HIF-podjedinica—HIF-1 , HIF-2 i HIF-3 — poznato je da epitelne stanice bubrežnih tubula eksprimiraju HIF-1 (Tanaka et al ., 2016.). Prethodne studije su pokazale prolaznu ili regionalnu akumulaciju HIF ububregsa CKD (Goldfarb et al., 2006; Yu et al., 2012), a ovaj HIF se aktivira u smanjenoj tenziji kiseonika u miljeu CKD. Neprilagođenost hipoksiji kod CKD-a može biti uzrokovana prisustvom faktora koji suzbijaju HIF puteve (Asai et al., 2016; Tanaka et al., 2013; Thangarajah et al., 2009). Zaštitni efekti aktivacije HIF-a prijavljeni su na nekoliko životinjskih modela, uključujući dijabetičke pacove izazvane streptozotocinom i štakore sa 5/6 nefrektomije (Deng et al., 2010; Nordquist et al., 2015). dr.sc. inhibitori su nedavno privukli pažnju kao novi terapijski pristupi bubrežnoj anemiji kod pacijenata sa CKD (Akizawa et al., 2019; Chen et al., 2017, 2019; Coyne et al., 2017; Miyata et al., 2011; Pergola et al. ., 2016; Provenzano et al., 2016). Međutim, detalji progresije bubrežne hipoksije i način na koji dolazi do akumulacije HIF-a ububregsa CKD, ostaju nejasni. Hidroksilacija HIF-a ovisi o kisiku u citosolu, te je stoga važno mjeriti intracelularnu i ekstracelularnu napetost kisika. Postoji nekoliko metoda koje se koriste za mjerenje napetosti kisika, uključujući upotrebu mikroelektroda ili magnetnu rezonancu (BOLD-MRI) ovisno o nivou kisika u krvi. Za kvantitativno mjerenje intracelularnog statusa kisika koristili smo fosforescentnu životnu mikroskopiju (PLIM) (Hirakawa et al., 2017; Yoshihara et al., 2015). BTPDM1 je fosforescentna boja na bazi kompleksa iridijuma (III) BTP, (bp)2Ir(acc) (bp=benzoat-piridin, aac=acetilaceton) sa katjonskom dimetilamino grupom, koja je pasivno distribuira u intracelularnim lizozomima. Sintetiziran je kao fosfoskovita sonda za mjerenje intracelularnog pritiska kiseonika (Yoshihara et al., 2015). PLIM sa BTPDM1 omogućio je stjecanje slika visoke rezolucije parcijalnog tlaka kisika u bubrežnim tubularnim stanicama na površini bubrega normalnih miševa, dajući podatke koji ukazuju na prisutnost gradijenta kisika, čak i u normalnim bubrezima (Hirakawa et al., 2018. ).

Postoje gradijenti kiseonika u živim organima, uključujućibubrezi, čak i pod normalnim uslovima (Hirakawa et al., 2018; Kietzmann, 2017; Zhdanov et al., 2015), pa se takvi gradijenti mogu očekivati ​​i kod CKD. Hipoperfuzija je uzrokovana razrjeđivanjem mikrovaskulature u CKD, u kojoj progresivna ozljeda glomerula rezultira smanjenjem peritubularnog kapilarnog protoka krvi, pogoršavajući intersticijsku fibrozu. Intersticijska fibroza otežava difuziju i opskrbu kisikom u tubularnim stanicama i dovodi do razrjeđivanja mikrovaskulature, dodatno pogoršavajući tubulointersticijsku hipoksiju (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Biološki efekti hipoperfuzije, međutim, ostaju nejasni, jer je većina studija istraživala efekte hipoksije i HIF-1 na kultivisane ćelije u uslovima homogene perfuzije i napetosti kiseonika (Rexius-Hall et al., 2017). Prethodne studije su pokazale da jednoslojne kultivisane ćelije prekrivene pokrovnim stakalcem daju dobar model hipoperfuzije izazvane barijerom za difuziju u medijumu kulture. Modelirana hipoperfuzija je povezana s gradijentom kisika jer pokrovni stakal sprječava difuziju kisika s vrha medija u stanice (Pitts & Toombs, 2004; Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015). U monosloju kultiviranih stanica prekrivenih pokrovnim staklom, unutarćelijska napetost kisika opada s udaljenosti od ruba pokrovnog stakla zbog ograničene difuzije kisika u kultivirane stanice. Kao rezultat, formira se gradijent kisika od ruba do centra pokrovnog stakala, a unutarćelijska napetost kisika može pasti na anoksični raspon u središtu pokrovnog stakala (Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015) . U trenutnoj studiji fokusirali smo se na aktivaciju HIF-a i istraživali da li postoji promjena u ekspresiji HIF-a neovisna o kisiku u prisustvu hipoperfuzije s gradijentom kisika. Pošto hipoperfuzija sa gradijentom kiseonika postoji u bubrežnim tubulima in vivo, posmatranje efekata nezavisnih od kiseonika na ekspresiju HIF u modelu pokrivača može pružiti uvid u mehanizam koji leži u osnovi insuficijencije akumulacije HIF-a u CKD.

ekstrakt cistancheza bubreg

2|MATERIJALI I METODE

2.1|Ćelijska kultura

Kultivisane ćelije su inkubirane u vlažnom inkubatoru sa 5% CO2. Hipoksična inkubacija je obavljena u ličnom CO2/multi-gas inkubatoru APM-30D (Astec). Anoksija je izazvana kesom za anoksiju, AnaeroPack-om i setovima za anaerobnu kultivaciju #A-13 (Mitsubishi Gas Chemical).

HK-2 ćelije (Homo sapiens, čovjekbubreg, mužjak, CRL- 2190, ATCC, RRID: CVCL_0302), ovekovečena epitelna ćelijska linija proksimalnih tubula iz normalnog bubrega odraslog čovjeka, uzgajana je u Dulbecco-ovoj modificiranoj Eagle's mediju/hranjivoj mješavini F{{2} } Šunka (DMEM/F12) (D8062, Sigma Aldrich) koja sadrži 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS) (F7524, Sigma Aldrich) i otopinu penicilina-streptomicina (15070063, Thermo Fisher Scientific) u posudi za kulturu od 10 cm. Za prolaz, ćelije HK-2 su disocirane sa tripsinom (204-16935, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) i centrifugirane na 300 g 5 min.

HeLa ćelije raka grlića materice i ljudski embrionbubregćelije 293 (HEK293) su uzgajane u DMEM sa niskom (1000 mg/L) glukoze (D6046, Sigma Aldrich) koja sadrži 5 procenata FBS u posudi za kulturu od 10 cm. Ove ćelije su proslijeđene kao HK-2 ćelije.

Epitelne ćelije proksimalnih tubula bubrega (RPTEC) (CC- 2553, Cambrex) održavane su korištenjem RenaLifeTM Comp kompleta (LRC-LL0025, Lonza Ltd.). Za prolaz, RPTEC-ovi su disocirani pomoću tripsina, neutralizirani s Tripsin Neutralizing Solution (CC-5002, Lonza Ltd.) i centrifugirani na 200 g 5 min.

2.2|Uspostavljanje hipoperfuzijskog modela postavljanjem pokrovnog stakala

Poklopci okruglog oblika prečnika 15 mm (C015001, Matsunami) su očišćeni ultrazvukom i pohranjeni u 99,5 posto etanola prije upotrebe. Korištene su dvije metode, zasnovane na posmatranju ćelija izvan pokrovnog stakala.

Jednoslojne kultivisane ćelije su u sendviču između pokrovnog stakala i dna posude (slika S1a,b), ili alternativna metoda (slika S1c), kao što je opisano u nastavku. Odabrana je tradicionalna ili alternativna metoda za uspostavljanje našeg modela pokrovnog stakala za snimanje uživo, bilo da se radi o snimanju kisika ili PH. Za imunocitohemiju (ICC) odabrana je alternativna metoda, jer se pri korištenju tradicionalne metode većina ćelija često odvaja od dna posude tokom uklanjanja pokrovnog stakla radi fiksacije ćelije (slika S2a).

2.2.1|Tradicionalna metoda

Prvog dana, ćelije su stavljene na dno posude od stakla od 27 mm (3910-035, Iwaki) na ušću od 100 posto * (približno 5,0 × 105 po posudi). Uzgajani su u DMEM/F12 koji sadrži 10 posto FBS bez rastvora antibiotika preko noći. Dana 2, na kultivisane ćelije je stavljen pokrovni stakal za naznačeni period (Slika S1b).

2.2.2|Alternativni metod

Ćelije su posađene na pokrovno staklo u posudu za kulturu od 35 mm na 100 posto konfluencije (približno 5,0 × 105/posudi) na Dan.

1. Uzgajani su u DMEM/F12 koji sadrži 10 posto FBS bez rastvora antibiotika preko noći. Drugog dana, pokrivno staklo je obrnuto, kako bi se pričvrstila površina njegovih ćelija na dno nove posude od 27 mm od stakla na određeni period (slika S1c).

Napravili smo i model pokrovnog stakala korištenjem pokrovnih stakala okruglog oblika promjera 10 mm (CS01005, Matsunami) (slika S2b).

2.3|Živa slika kiseonika sa BTPDM1

Kultivisane ćelije su pripremljene 1. dana, kao što je gore opisano. Drugog dana, ćelije su dva puta isprane Hanksovom balansiranom otopinom soli (HBSS) (H8264, Sigma Aldrich) i inkubirane sa 500 nM BTPDM1, kationskom lipofilnom bojom na bazi iridijuma koja se koristi kao intracelularna fosforescentna sonda (Yoshihara et al., 2015), u DMEM/F12 bez fenol crvenog (21041-025, Thermo Fisher Scientific) 30 min. Nakon što su ćelije dvaput isprane sa HBSS, one su bile u sendviču između pokrovnog stakala i dna posude, kao što je gore opisano. Intenzitet fosforescencije iz BTPDM1 u kultivisanim ćelijama prekrivenim pokrovnim stakalcem opažen je pomoću ekscitacionog i emisionog filtera, a fosforescencija BTPDM1 (Hirakawa et al., 2015) detektirana je pomoću fluorescentnog mikroskopa, BZ-X710 (Keyence Corporation). Slike dobijene invertovanim fluorescentnim mikroskopom su prilagođene za svjetlinu i kontrast pomoću softvera za analizu BZ-X.

2.4|Imunocitohemija

Ćelije na pokrovnom staku kultivisane su sa 200 µM pimonidazol HCl (HP3-100, Hypoxyprobe, Inc.) u DMEM/F12 bez fenol crvenog tokom 1 h, nakon čega je pokrovno staklo okrenuto i pričvršćeno na poklopnu staklenu posudu, kao prethodno opisano. Ćelije su zatim kultivisane u DMEM/F12 bez fenol crvenog tokom određenog perioda. Kada se pimonidazolno kontra bojenje nije koristilo, predtretman pimonidazolom je izostavljen.

Nakon završetka perioda kulture, svaki pokrovni stakal je sakupljen, a ćelije su odmah fiksirane metanolom/acetonom (1:1) na ledu, gdje su ostajale 30 min. Nakon dva puta ispiranja sa Dulbeccovim fosfatnim puferom (PBS) (D5652, Sigma Aldrich), ćelijska membrana je permeabilizirana 30 minuta, inkubirana sa 5 posto goveđeg serumskog albumina (BSA) (A3059, Sigma Aldrich, nakon toga 30 minuta). sa proteinskim blokom bez seruma (X0909, DAKO) 10 min. Ćelije su obojene prvim antitelom, a zatim drugim, fluorescentnim antitelom. Lista prvih antitela data je u tabeli S1. FITC-svinjski poliklonalni anti-zečji imunoglobulin (F0205, 1:20 razrjeđenje, DAKO) korišten je kao prvo antitijelo ako je domaćin bio zec. Fluorescentno antitijelo Alexa Fluor 594 streptavidin (S11227, razrjeđenje 1:500, Thermo Fisher Scientific) korišteno je kao prvo antitijelo ako je domaćin bio miš, a zatim biotinilirani antimišji IgG (H plus L) (BA{{23} }, 1:1000 razrjeđenje, Vector Laboratories), kao drugo antitijelo. Nuklearno bojenje je izvedeno upotrebom bisBenzimide H 33342 trihidrohlorida (B2261, Sigma Aldrich) za svaki uzorak.

Fluorescentni signali su posmatrani pomoću invertnog fluorescentnog mikroskopa, BZ-X710 (Keyence Corporation) sa sljedećim filterima: Texas Red sa talasnom dužinom ekscitacije (Ex) od 560/40 nm, talasnom dužinom emisije (Em) od 630/75 nm, GFP ( Primjer: 470/40 nm, Em: 525/50 nm) i DAPI (Primjer: 360/40 nm, Em: 460/50 nm). Slike su prilagođene za svjetlinu i kontrast pomoću softvera za analizu BZ-X.

2.5|ICC HIF ćelija HK-2 tretiranih kobalt hloridom

Alternativna metoda je modificirana kako bi se proizveo model pokrovnog stakala HK-2 ćelija tretiranih kobalt hloridom. HK-2 ćelije su zasijane pri gustini polukonfluenta (2,5 × 105/posuda) na pokrovno staklo prvog dana i tretirane sa 300 µM kobalt hlorid heksahidrata (C 8661, Sigma Aldrich) tokom 16 sati Dan 2. Trećeg dana, pokrovno staklo je obrnuto kako bi se površine ćelija pričvrstile na dno nove posude od stakla od 27 mm u trajanju od 3 h, a izveden je ICC HIF.

2.6|Western blotting

Za istraživanje akumulacije HIF{{0}} pod različitim tenzijama kiseonika i na različitim nivoima pH, 1.0 × 106 HK-2 ćelija po posudi za kulturu od 10 cm inkubirani su pod normoksijom, 2 posto kisika, 1 posto kisikom ili anoksijom, 5 sati, ili u DMEM/F12 na pH 7,4, pH 6,0 ili pH 5,0 tokom 5 sati.

Ove ćelije su lizirane u RIPA puferu koji sadrži 50 mM Tris-pufera (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 w/v posto natrijuma deoksiholat, 0,1 w/v procenat SDS i 1,0 w/v procenat NP40.

Za western blotting, SDS pufer za uzorke koji sadrži {{0}}.35 M Tris-HCl (pH 6,8), 10 posto SDS, 36 posto glicerola, 0,012 posto bromofenol plavog i 0,1 M ditiotreitola (DTT) je dodan proteinima. Proteini koji sadrže SDS pufer za uzorke su eluirani ključanjem na 95 stepeni tokom 5 minuta.

Proteini su razdvojeni elektroforezom na 10 posto SDS poliakrilamidnih gelova. Proteini su zatim prebačeni na AmershamTM HybondTM PVDF membranu (10600023, GE Healthcare) u transfer puferu (48 mM pufer na bazi Tris, 39 mM glicin, 0,04 posto SDS i 20 v/v postotak metanola) koristeći Trans-Blot® TurboTM Transfer System (Bio-Rad). Membrane su inkubirane na sobnoj temperaturi sa primarnim antitijelima, anti-HIF1 antitijelima (NB100-134, 1:500 razrjeđenje, Novus Biologicals, RRID: AB_350071) i anti-aktinskim antitijelima (A2066 , 1:2000 razrjeđenje, Sigma Aldrich, RRID: AB_476693), a zatim u sekundarnom antitelu, poliklonalni kozji anti-zečji imunoglobulin/HRP (P0448, 1:10000 razrjeđenje, DAKO, RRID: AB{{26 }}). PierceTM ECL Plus Western Blotting supstrat (32132, ThermoFisher Scientific) je korišten za detekciju. Hemiluminiscencija je uočena korišćenjem Luminoimage Analyzer ImageQuantLAS4000mini (GE Healthcare). Reproducibilnost je potvrđena izvođenjem najmanje tri nezavisna eksperimenta. Intenzitet traka je kvantifikovan korišćenjem softvera Nacionalnog instituta za zdravlje ImageJ (Schneider et al., 2012).

2.7|Luciferazni reporterski test

Ispitivanje reportera luciferaze je izvedeno za mjerenje akumulacije HIF1 u inkubaciji homogene hipoksične kulture. Prethodno smo konstruisali označeni gen luciferaze vođen elementom koji reaguje na hipoksiju (HRE) i razvili smo reporterski vektor koji reaguje na hipoksiju (Transgene Construction). Ovo je konstruirano od tandem kopija HRE iz gena vaskularnog endotelnog faktora rasta štakora subkloniranog u 5' regiju transkripcione jedinice am CMV-promotor-luciferaze (pre-Luc) (Chiang et al., 2011; Tanaka et al. al., 2004).

HK{{0}} ćelije u koncentraciji od 1,0 × 105 po jažici su pripremljene u 12-pločama za kulturu bunara (150628, Thermo Fisher Scientific). Ćelije su ko-transficirane sa 500 ng vektora pGL3-Basic HRE-luciferaze i 30 ng pRL-SV40 Renilla luciferaze kontrolnih vektora (Promega), koristeći 2 µl FuGENE® HD transfekcionog reagensa (E2311, Promega) po dobro. HK-2 ćelije ko-transficirane sa 500 ng pGL3-baznih vektora luciferaze krijesnice i 30 ng kontrolnih vektora pRL-SV40 Renilla luciferaze (Promega) korištene su kao negativna kontrola.

Transficirane ćelije su inkubirane u uslovima normoksije, 2% hipoksije, 1% hipoksije ili anoksične vrećice, 5 h. Ćelije su zatim sakupljene korištenjem 100 µl pufera za pasivnu lizu proteina, za dual luciferazni test. Za mjerenja je korišten luminometar LB9507 (EG i Berthold). Da bi se ispravila efikasnost transfekcije, relativna vrijednost svjetlosne jedinice luciferaze krijesnice podijeljena je s onom Renilla luciferaze.

cistanche za ed

2.8|Analiza apoptoze

Kultivisane ćelije su prekrivene pokrovnim staklom 0 min, 15 min, 30 min, 1 h, 3 h, 6 h i 24 h, a zatim sakupljene upotrebom tripsina. Ćelije tretirane sa 3% vodonik peroksida (081- 04215, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) tokom 30 minuta pripremljene su kao apoptotska kontrola. Kvantitativna analiza apoptoze izvršena je korišćenjem Muse Annexin V i kompleta mrtvih ćelija (MCH100105, Millipore) u Muse™ Cell Analyzer (Millipore), prema uputstvima proizvođača.

2.9|Kvantitativni PCR u realnom vremenu (qRT-PCR)

Potpuna ekstrakcija RNK i sinteza cDNK obavljene su prema uputstvima proizvođača za RNAiso Plus (9109, Takara) i PrimeScript™ RT Master Mix (RR036B, Perfect Real Time) (Takara) respektivno. PCR u realnom vremenu je izveden korištenjem THUNDERBIRD SYBR qPCR Mixa (QPS- 201, Toyobo) u CFX Connect PCR sistemu za detekciju u realnom vremenu (Bio-Rad). Nivoi transkripta su normalizovani na nivo ekspresije mRNA -aktina. qRT-PCR je izveden u tri primjerka korištenjem gen-specifičnih prajmera. HIF-1 je pojačan korištenjem prajmera prema naprijed, 5′-CCATTAGAAAGCAGTTCCGC-3′ i obrnutom, 5′-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3′. -aktin je amplificiran korištenjem prajmera naprijed, 5′-TCCCCCAACTTGA GATGTATGAAG-3′ i reverznog 5′-AACTGGTCTCAAG TCAGTGTACAGG-3′ prajmera.

2.10|Transfekcija sa siRNA

Za ispitivanje RNAi-indukovanog HIF-1 nokdauna u HK-2 ćelijama, 5.0 × 104 HK-2 ćelija po jažici je pripremljeno u pločama sa šest jažica. Dvije vrste RNAi—HIF-1 siRNA (siHIF-1 #1 [HSS104774, Thermo Fisher Scientific] i siHIF-1 #2 [HSS104775, ThermoFisher Scientific])— korištene su s Lipofectamine RNAiMAX Reagens za transfekciju (Thermo Fisher Scientific). Kao negativna kontrola korištena je Stealth RNAi™ siRNA Negative Control Med GC Duplex #3 (12935-113); Pomiješano je 1,5 µl svake siRNA i 5 µl RNAiMAX. Ćelije transficirane siRNA su inkubirane u normoksičnim ili hipoksičnim (1 posto O2) uslovima 48 h i RNA je ekstrahirana. Efikasnost Knockdown-a-HIF-1 ispitana je pomoću qRT-PCR.

2.11|Živo snimanje efekata PH gradijenta

Vizualizirali smo intracelularni pH gradijent živih stanica ispod pokrovnog stakala. Ćelije su tretirane pHrodo Green AM intracelularnim pH indikatorom (p35373, ThermoFisher Scientific) prema uputstvima proizvođača, prije implementacije modela pokrovnog stakala. Invertirani fluorescentni mikroskop, BZ-X710 (Keyence Corporation) sa GFP filterom je korišten za posmatranje vremenske tranzicije gradijenta intenziteta fluorescencije ispod pokrovnog stakala.

2.12|Kvantitativna analiza HIF prstena

2.12.1|Mjesto prstena FZO

Izmjerili smo udaljenost HIF prstenova i područja pozitivnih na pimonidazol od rubova pokrovnog stakala koristeći ImageJ, kako slijedi. Određene su površine spoljašnjeg i unutrašnjeg kruga HIF prstena i pimonidazol pozitivnog kruga i izračunat je poluprečnik svakog kruga. Svaka vrijednost je oduzeta od 7,5 mm, što je radijus pokrovnog stakala od 15 mm, da bi se izračunala njegova udaljenost od ruba pokrovnog stakala. Izvedena su tri nezavisna eksperimenta ICC-a HIF-a u svakom stanju.

2.12.2|Definicija HIF prstena

Koristili smo fluorescentne slike dobivene iz modela pokrovnog stakala inkubiranog u normoksiji i neutralnom pH. Definisali smo mjesto HIF prstena i njegovu vanjsku i unutrašnju stranu kao 2.5–3.0 skale (0.22–0.45 mm), 0.5 –1.0 skala (1,12–1,35 mm) i 5.0–5,5 skala (2,24–2,47 mm) od ivice pokrovnog stakala, respektivno, koristeći ImageJ. Izmjerili smo pet lokacija HIF-1 signala po uzorku i izračunali prosjek. Izvedena su tri nezavisna eksperimenta ICC-a HIF-a.

cistanche ekstrakt u prahu

2.13|Mjerenje tlaka kisika pomoću PLIM slike

2.13.1|Izgradnja kalibracione linije za merenje pritiska kiseonika

Kalibraciona kriva HK-2 ćelija je napravljena na osnovu metode opisane u našem prethodnom izvještaju (Yoshihara et al., 2015). HK-2 ćelije napunjene sa 500 nM BTPDM1 tokom 30 minuta uzgajane su u višegasnom inkubatoru sa promjenjivom koncentracijom kisika opremljenom invertiranim fluorescentnim mikroskopom koji je bio povezan na sistem mjerenja životnog vijeka. Kalibraciona linija zasnovana na Stern-Volmerovim analizama je konstruirana korištenjem životnog vijeka fosforescencije (PL) HK-2 ćelija pod nekoliko različitih tenzija kisika korištenjem

jednadžba (1)

gdje τp predstavlja PL u pO2, τ0 predstavlja PL u deoksigenaciji, kq predstavlja konstantu brzine gašenja, a pO2 predstavlja parcijalni pritisak kiseonika. Korištenjem ove kalibracijske linije, tlak kisika se može izračunati iz PL.

2.13.2|PLIM slika modela pokrivača

Pripremljene su HK-2 ćelije napunjene sa 500 nM BTPDM1 tokom 30 minuta. Model pokrovnog staka je konstruisan i kultivisan u višegasnom inkubatoru sa promenljivom koncentracijom O2 opremljenom invertovanim fluorescentnim mikroskopom, spojenim na sistem za merenje životnog veka.

Slike fosforescentne mikroskopije za životni vijek (PLIM) snimljene su korištenjem invertnog fluorescentnog mikroskopa opremljenog konfokalnim sistemom za skeniranje (Hirakawa et al., 2018). PLIM slike su dobijene nakon 30 min inkubacije u 21 posto O2 ili 4 posto O2. Četiri PLIM slike po uzorku, iz gornjeg, donjeg, lijevog i desnog područja u blizini ruba pokrovnog stakalca, uzete su da bi se odredio prosječni PL, uzimajući u obzir varijacije PL u pokrovnom stakalcu.

2.13.3|Identifikacija HIF prstena na PLIM slici

Pimonidazol je bio pozitivan ispod 10 mmHg pritiska kiseonika. PL ekvivalent 10 mmHg pritiska kiseonika bio je 4034,6 ns, prema kalibracionoj liniji, tako da se spoljna linija kruga pimonidazola na PLIM slici mogla identifikovati. Nakon toga, mjesta vanjskog i unutrašnjeg HIF prstena na PLIM slici mogu se pronaći korištenjem kvantitativne analize udaljenosti. Izmjerili smo raspon prosječnih PL ekvivalentnih HIF prstenu u 21 posto O2 i 4 posto O2.

2.13.4|Merenje pritiska kiseonika u HIF prstenu

Izračunali smo opseg pritisaka kiseonika u HIF prstenu iz PL-a, koristeći kalibracionu liniju. PLIM slike su analizirane pomoću SPCImage 5.0 (Becker & Hickl GmbH).

2.14|Statistička analiza

Dunnettov test je korišten za poređenje eksperimentalne i kontrolne grupe, a smatralo se da vrijednosti < .05="" ukazuju="" na="" statistički="" značajne="" razlike.="" studentovi="" t-testovi="" su="" korišteni="" za="" poređenje="" tri="" ili="" više="" grupa,="" a="" primijenjena="" je="" bonferronijeva="" prilagođena="" p-vrijednost.="" sve="" statističke="" analize="" su="" obavljene="" pomoću="" jmp="" pro="" ver13.2.1="" (sas).="" pretpostavlja="" se="" da="" su="" vrijednosti="" izvedene="" iz="" normalno="" raspoređene="" populacije="" i="" prikazane="" su="" kao="" srednja="" vrijednost="" ±="" standardna="" devijacija="">

šta je cistanche

3|REZULTATI

3.1|Formiranje gradijenta kisika u modelu hipoperfuzije

Potvrdili smo postojanje gradijenta kiseonika u modelu hipoperfuzije izazvanog postavljanjem pokrovnog stakla direktnom procenom tenzije kiseonika, koristeći fosforescenciju. Mjerenje intenziteta fosforescencije može predvidjeti približan trend pritiska kisika (Hirakawa et al., 2015; Yoshihara et al., 2015). Uočili smo intenzitet fosforescencije modela pokrovnog stakala HK-2 ćelija tretiranih sa BTPDM1. Slike intenziteta fosforescencije pokazale su hipoksiju u većini područja unutar pokrovnog stakala, ali ne i hipoksiju blizu ruba, što je zapažanje koje sugerira postojanje gradijenta kisika oko ruba pokrovnog stakala u HK-2 ćelijama prekrivenim pokrovni stakal (slika 1a). Budući da intenzitet fosforescencije ovisi o koncentraciji sonde i vremenu ekscitacije, mjerenje životnog vijeka fosforescencije (PL) je korisno za kvantitativnu analizu tlaka kisika (Yoshihara et al., 2015). Dakle, za kvantitativno mjerenje napetosti kiseonika kultiviranih ćelija oko ivice pokrovnog staka, dobili smo PLIM slike HK-2 ćelija prekrivenih pokrovnim staklom u trajanju od 30 minuta (slika 1b). PL se produžavao kako se povećavala udaljenost od ruba pokrovnog stakla. Potvrdili smo da se napetost kisika, izračunata korištenjem kalibracijske linije (slika S3), smanjivala kako se rastojanje od ruba pokrovnog stakala povećavalo, pružajući dokaz o postojanju gradijenta kisika oko ruba pokrovnog stakala (slika 1c). Ispitivanje vremenskog profila intenziteta fosforescencije pokazalo je da se gradijent kiseonika počeo formirati 10 minuta nakon postavljanja pokrovnog stakala.

(Slika 1d).

3.2|Jedinstvena HIF-1 distribucija u modelu hipoperfuzije, "HIF prsten"

Ispitivali smo distribuciju HIF-1 u modelu hipoperfuzije sa gradijentom kiseonika. ICC HIF-1 u ćelijama HK-2 pokazao je poboljšanje u obliku krofne na rubu pimonidazol-pozitivnog područja, koje smo nazvali "HIF prsten" (slika 2a). Intenzitet HIF-1 signala bio je značajno veći na HIF prstenu nego u njegovim unutrašnjim ili vanjskim područjima (slika 2b). Ovaj fenomen je potvrđen korištenjem ICC-a sa drugim HIF-1 antitijelom (Slika S4a) ili drugim tubularnim ćelijskim linijama (Slika S4b,c). Također smo izvršili ICC analizu HIF-1 u drugim vrstama kultiviranih ćelija, kao što su HeLa ćelije raka grlića materice. Iako je slaba adhezija ovih ćelija na pokrovno staklo otežala detaljnu procjenu distribucije HIF-1, uočili smo povećanje HIF-1 u obliku krofne u HeLa ćelijama (slika S4d).

HIF prsten i pimonidazol pozitivno područje počeli su da se formiraju nekoliko sati nakon postavljanja pokrovnog stakala, a HIF prsten je izgledao statičan za 3 h (slika 2c). Knockdown HIF-1 je rezultirao nestankom signala HIF-1, uključujući HIF prsten (slika 2d, slika S4e), što ukazuje da je HIF prsten zavisan od HIF-1 .

Da bismo istražili mogućnost da formiranje HIF prstena zavisi od kiseonika, istražili smo distribuciju HIF-1 u modelu pokrovnog stakala pod inkubacijom sa različitim tenzijama kiseonika. Posudu smo smjestili u hipoksične komore s različitim tenzijama kisika odmah nakon izrade modela pokrovnog stakala. Tokom hipoksične inkubacije, primijetili smo da se i HIF prsten i pimonidazol pozitivno područje šire prema van (Slika 3a). Izmjerili smo udaljenost svakog HIF prstena i pimonidazol-pozitivne površine od ruba pokrovnog stakala pod normoksijom, 4 posto O2 i 1 posto O2 inkubacije. I HIF prsten i pimonidazol pozitivno područje su se proširili prema van kako se smanjila napetost okolnog kiseonika (slika 3b). Ovi rezultati su pokazali da je HIF prsten zavisan od HIF-1 i napetosti kiseonika.

Kako bismo potvrdili da je akumulacija u obliku krofne specifičan fenomen HIF-a, uradili smo ICC sa genima za održavanje domaćinstva u modelu pokrovnog stakala. Signali GAPDH i aktina održavani su na cijeloj površini pokrovnog stakalca i bili su uporedivi između regije HIF prstena i ostalih regija (Slika S5a,b).

3.3|Merenje opsega pritiska kiseonika HIF prstena

Potvrdili smo prstenasto povećanje akumulacije HIF-1 u kultivisanim ćelijama prekrivenim pokrovnim stakalcem, što je fenomen koji zavisi od tenzije kiseonika. Da bismo odredili opseg uključene napetosti kiseonika, analizirali smo pritisak kiseonika u HIF prstenu koristeći tehniku ​​životnog veka fosforescencije. Dobili smo PLIM slike modela pokrovnog stakala nakon 30 min inkubacije u 21 posto O2 ili 4 posto O2 (Slika 4a). HIF prsten formiran je na rubu pimonidazolnog kruga u ICC-u HIF-a (slika 3b). Identifikovali smo mjesto na PLIM snimku koje je bilo ekvivalentno pimonidazol-pozitivnom području u ICC-u HIF-a i nakon toga identificirali mjesto koje odgovara HIF prstenu (slika 4b), koristeći kvantitativnu analizu podataka o udaljenosti od HIF prstena i područje pozitivno na pimonidazol (slika 3b). Također smo izmjerili raspon PL-a HIF prstena, a zatim koristili kalibracijsku liniju (slika S3) za izračunavanje tlaka kisika u HIF prstenu u 21 posto O2 (4,20 [3,46–4,97] ~35,9 [28,5–44,9] mmHg) i 4 posto O2 (2,19 [0,21–4,32] ~20,4 [17,1–24,1] mmHg) (Slika 4c).

3.4|HIF-1 akumulacija pod homogenom napetosti kiseonika

Dok se slabi signali HIF-1 izvan HIF prstena u modelu pokrivača mogu pripisati nedovoljnoj hipoksiji, oni unutar prstena, gdje je HIF-1 trebao biti snažnije aktiviran nižom tenzijom kiseonika, moraju biti kontrolirani fenomenom neovisnim o kisiku. Da bismo ispitali fenomene koji uzrokuju nedostatak maksimalne akumulacije HIF-1 u anoksičnom području koji se javlja samo u modelu hipoperfuzije, ispitali smo da li postoji inverzna veza između napetosti kiseonika i akumulacije HIF-1 u inkubaciji sa homogenom napetosti kiseonika. Western blot analiza ćelijskih lizata pod različitim homogenim tenzijama kiseonika pokazala je povećanje akumulacije HIF-1 tokom anoksične inkubacije (Slika 5a). Test reportera HRE-luciferaze je takođe pokazao da je akumulacija HIF-1 povećana sa nižom tenzijom kiseonika u uslovima homogene tenzije kiseonika (Slika 5b). Ovi rezultati su pokazali da je akumulacija HIF-1 zavisila od tenzije kiseonika, sa maksimalnom akumulacijom uočenom u anoksičnom opsegu. Karakteristike HIF-1 trebale bi varirati između modela hipoperfuzije i modela sa homogenom tenzijom kiseonika. Spekulisali smo da bi jedinstveni fenomen akumulacije HIF-1 u ovom hipoperfuzijskom modelu mogao biti određen faktorom koji nije tenzija kiseonika.

3.5|Formiranje HIF prstena bilo je nezavisno od doktora nauka

Ispitali smo da li je degradacija HIF-1, mogući mehanizam formiranja HIF-prstena, povećana unutar HIF prstena. Činilo se da je ova ideja nevažeća, jer hidroksilacija od strane doktora nauka, proces koji ograničava brzinu razgradnje HIF-a, zahtijeva kiseonik kao supstrat. Kobalt hlorid se široko koristi kao hemijski HIF stabilizator. Konstruisali smo model pokrivača HK-2 ćelija tretiranih kobalt hloridom i izvršili ICC analizu HIF-a. HIF-1 signal se nije povećao unutar HIF prstena, što je postalo nejasno zbog povećanog signala HIF-1 izvan prstena (slika 6c). ICC ćelija HK-2 s nokdaunom PHD2, za koju se vjeruje da je primarna HIF prolil hidroksilaza u eksperimentima sa ćelijskom kulturom (Strowitzki et al., 2019), dao je slične rezultate (Slika S6). Ovi rezultati su pokazali da PHD-VHL osa degradacije HIF nije povezana sa formiranjem HIF prstena.

3.6|Utjecaj pH na akumulaciju HIF-1

Prethodni izvještaj opisuje korištenje modela pokrovnog stakala srčanih miocita koji su imali pad pH unutar pokrovnog staka (Pitts & Toombs, 2004). Istraživali smo pH ispod pokrovnog stakla i njegov uticaj na formiranje HIF prstena. HK-2 ćelije smo tretirali intracelularnim pH indikatorom, čiji intenzitet fluorescencije omogućava procjenu pH u ćelijama. Snimke uživo su pokazale da se pH smanjio na većini unutrašnjeg područja, ali ne blizu ruba pokrovnog stakala, što sugerira postojanje pH gradijenta oko ruba u modelu pokrovnog stakala (slika 6a). Kvantitativna analiza korelacije između intenziteta fluorescencije i udaljenosti od ruba pokrovnog stakala je pokazala da je prva bila povišena kako se udaljenost povećavala, što je zapažanje koje podržava postojanje pH i gradijenata kisika oko ruba pokrovnog stakala (slika 6b). Western blot analiza ćelijskih lizata pod homogenim koncentracijama kiseonika pokazala je da inkubacija sa medijumom pH 5,0 potiskuje akumulaciju HIF-1 u uslovima hipoksije (Slika S7a–d). Također smo potvrdili da se akumulacija HIF-1 pod hipoksijom u različitim pH uvjetima smanjila ispod pH 6,0 (Slika S8a–c).

U jednom izvještaju je naglašena važnost blago kiselih uslova, na pH oko 6.0. Prema ovoj studiji, reoksigenacija nakon hipoksije je zakiselila medij, što je izazvalo nukleolarnu sekvestraciju VHL-a. Zauzvrat, degradacija HIF-a je spriječena u C2C12 miotubama, PC12 neuronima i 786-0 ćelijama raka bubrega (Mekhail et al., 200}4). U našem istraživanju nije došlo do promjene distribucije VHL u tubularnim ćelijama između regija sa akumulacijom HIF-1 i onih u kojima je on potisnut, u modelu pokrovnog stakala sa pH vrijednostima od 5.0 do 7,4 (Slika S9a–c). Tubularne ćelije su izložene širokom rasponu pH uslova (Burke et al., 1999; Pavuluri et al., 2019; Raghunand et al., 2003), pa smo istraživali varijaciju HIF prstena u medijima različitog pH. vrijednosti između 5,0 i 8,5. HIF prsten je jasno uočen u medijima sa pH 8,5 i 7,4 (Slika 6c). HIF prsten je takođe postojao na pH 6,5, ali je bio zamagljen (Slika 6c). HIF-1 signal je oslabljen u cijeloj oblasti pokrovnog stakala pri pH 5,0. (Slika 6c). Izvršili smo dalju kvantitativnu analizu pozicionog odnosa između HIF prstena i ruba pimonidazol-pozitivnog područja (slika 7a) i otkrili da položaj prstena varira u zavisnosti od pH. Unutrašnji krug je imao tendenciju širenja prema van pri pH 6,5, u poređenju sa pH 7,4, dok se spoljni krug značajno smanjio prema unutra pri pH 8,5, na osnovu ivice pimonidazol-pozitivnog područja (slika 7b,c). Također smo potvrdili da su aktivnosti gena za održavanje domaćinstva održavane u modelu pokrovnog stakala pod kiselom inkubacijom (Slika S10). Stoga se čini da pH igra važnu ulogu u mehanizmu koji leži u osnovi formiranja HIF prstena.

4|DISKUSIJA

U ovoj studiji smo identifikovali jedinstvenu distribuciju HIF-1 u bubrežnim tubularnim ćelijama, koristeći model hipoperfuzije izazvane postavljanjem pokrovnog stakala. Otkrili smo da su formiranje i održavanje HIF prstena regulirani tlakom kisika i pH, koji su postojali u gradijentu na rubu pokrovnog stakala modela pokrovnog stakala. Na osnovu ovih rezultata, predlažemo mogući mehanizam za formiranje HIF prstena, koji uključuje HIF-1 koji se akumulira sa smanjenjem tenzije kiseonika, a akumulacija je potisnuta zbog niskog pH na određenoj udaljenosti od ruba pokrovnog klizača (Slika 8. ).

Hipoperfuzija je izazvana razrjeđivanjem mikrovaskulature u CKD (Mimura & Nangaku, 2{{20}}10; Nangaku, 2006). U našem prethodnom radu koristili smo snimanje in vivo da bismo demonstrirali prisutnost gradijenta kisika u bubrežnim tubularnim stanicama normalnih mišjih bubrega (Hirakawa et al., 2018). Očekuje se da će tenzija kiseonika biti heterogena u tubularnim ćelijama u CKD. Međutim, ostaje nejasno da li postojanje hipoperfuzije sa gradijentom kiseonika utiče na sistem odbrane od hipoksije, HIF. U ovoj studiji istražili smo distribuciju HIF-a u kultivisanim ćelijama proksimalnih tubula pod modelom hipoperfuzije i otkrili da je gradijent kiseonika u kultivisanim bubrežnim tubularnim ćelijama uspešno modelovan korišćenjem okruglog staklenog pokrovnog stakla. Dokazi iz eksperimenata koji su koristili homogenu napetost kiseonika su pokazali da se HIF-1, čija hidroksilacija i naknadna degradacija uglavnom zavise od kiseonika, akumulirao. To je količina HIF-1 koja se povećava kako se tenzija kiseonika smanjuje. U našem modelu pokrovnog stakala, međutim, HIF-1 je potisnut u anoksičnom području i imao je najveću akumulaciju na određenoj udaljenosti od ruba pokrovnog stakala. Ova akumulacija HIF u obliku krofne nikada ranije nije prikazana. Pokazali smo da se formiranje HIF prstena može promatrati bez obzira na napetost kisika u atmosferi inkubacije, ali je njegova lokacija ovisila o napetosti kisika. Opseg napetosti kiseonika na HIF prstenu je izmeren na približno 4-20 mmHg korišćenjem PLIM-a sa BTPDM1. Većina prethodnih studija, koje su bile fokusirane na kultivisane ćelije u atmosferi sa homogenom tenzijom kiseonika, otkrile su da se količina HIF-1 proteina povećava u hipoksičnim ili anoksičnim rasponima (Ameri et al., 2002; Carrera et al. , 2014). Dakle, u našem modelu, na formiranje HIF prstena mora da utiče faktor koji nije napetost kiseonika; bio je nezavisan od Ph.D., proces koji je ograničavao stopu degradacije HIF-a. Proboj u rasvjetljavanju mehanizma formiranja HIF prstena bilo je naše otkriće uloge pH gradijenta, kao i gradijenta kisika, u modelu pokrivne usne, koji je ograničio dotok medija sličan hipoperfuziji in vivo. model. U ovom hipoperfuzijskom modelu, intracelularni pH se smanjivao kako se povećavala udaljenost od ruba pokrovnog stakalca, a uočen je pH gradijent oko ruba pokrovnog stakala. Pokazali smo da je akumulacija HIF-1 potisnuta pri niskom pH, oko pH 5,0, u poređenju sa inkubacijom na oko neutralnom pH pod homogenom tenzijom kiseonika. Spoljna ivica HIF prstena se proširila prema van pri pH 6,5, a unutrašnja ivica HIF prstena se smanjila prema unutra pri pH 8,5, na osnovu ivice pimonidazol-pozitivne oblasti. HIF prsten je bio zatamnjen u kiselim uslovima, a HIF-1 signal je nestao na pH 5,0. Stoga smo razjasnili važnost pH vrijednosti za formiranje HIF prstena u modelu pokrovnog stakala. Pokazali smo mogućnost da je HIF prsten nastao supresijom akumulacije HIF-1 niskim pH unutar prstena.

Nekoliko prethodnih studija koje su koristile metodu pokrivača koristile su ćelije raka. Prema jednom izvještaju koji koristi ćelijsku liniju hepatoma Hep3B, koja izražava crveni pomak zelenog fluorescentnog proteina (AcGFP1), ovisan o kisiku, živo snimanje stanica prekrivenih pravokutnim pokrovnim stakalcem pokazalo je crveni pomak kako se udaljenost od ruba pokrovnog stakala povećava (Takahashi & Sato, 2010). Emisioni spektar ćelija hepatoma se pomerio sa talasne dužine fluorescencije zelenog fluorescentnog proteina (GFP) do crvene kako se napetost kiseonika smanjivala. U drugoj studiji, napetost kiseonika u SCC-7 ćelijama sa okruglim pokrovnim stakalcem od 15-mm izmjerena je tehnikom fosforescentnog vijeka trajanja. Tenzija kiseonika iznosila je 6,9 ​​mmHg i 166 mmHg, izračunato iz PL, što je iznosilo 3,89 µs i 893 µs, 0–2 mm unutar i 0–1 mm izvan ruba pokrovnog stakala (Yoshihara et al., 2015). Metoda prekrivača je također korištena za srčane miocite, sistem koji je privukao pažnju kao obećavajući in vivo ishemijsko-reperfuzijski model. Kelly i saradnici su pokazali da su miociti prekriveni pokrovnim stakalcem podvrgnuti značajnim morfološkim promjenama tokom vremena, praćenih promjenama u potencijalu mitohondrijske membrane i dinamici plazma membrane, što je na kraju rezultiralo smrću miocita. Oni su također pokazali da unutarćelijski pH miocita prekrivenih pokrovnim stakalcem brzo pada na približno pH 4 u centru pokrovnog staka (Pitts & Toombs, 2004). Model pokrovnog staka, koji inhibira difuziju kisika ili nutritivne tvari u kultivisane stanice ispod pokrovnog staka, može oponašati in vivo model ishemijskih, normalnih i marginalnih zona u centru, izvan i na rubu pokrovnog stakla. Nekoliko studija koristilo je ovaj model kao ishemijsko-reperfuzijski model miocita in vitro (Chun et al., 2015; Pitts et al., 2008; Solhjoo & O'Rourke, 2015; Wang et al., 2012). Koliko nam je poznato, naša studija je prva koja je primijenila metodu pokrivača na tubularne ćelije. U našem sistemu, udaljenost od ruba pokrovnog stakala do područja ekvivalentnog napetosti kisika od 10 mmHg, gdje bi pimonidazol trebao postati pozitivan, bila je 1,22 mm, a napetost kisika se smanjila na samo nulu na udaljenosti od 2 mm od ruba pokrovnog stakala. . Ovaj rezultat može biti kompatibilan s prethodnim izvještajima koji koriste pokrovno staklo od oko 15 mm, što pokazuje postojanje gradijenta kisika najmanje unutar 2 mm od ruba (Akiyama et al., 2018; Yoshihara et al., 2015). Ispitivali smo stopu apoptoze ćelija ispod pokrivača (Slika S11) i otkrili da se GAPDH i aktin održavaju čak i unutar HIF prstena, što ukazuje da HIF prsten nije uzrokovan samo apoptozom ćelije ili smrću unutar HIF prstena.

Nekoliko studija mjerilo je napetost kisika u bubrezima korištenjem različitih metoda. Nekoliko primjera mjerenja napetosti kisika normalnih bubrega su sljedeći: 50 mmHg i 30 mmHg u korteksu i meduli pomoću mikroelektroda; i 49 mmHg i 41 mmHg u segmentima S1 i S2 tubularnih ćelija korteksa pomoću PLIM-a (Hirakawa et al., 2017, 2018; Zhang et al., 2014). Tenzija kiseonika kod bolesnih bubrega bila bi niža. Prema prethodnom izvještaju koji su koristili mikroelektrode kisika, dijabetički štakori su imali nižu napetost kisika u parenhima bubrega: 36 mmHg i 11 mmHg u korteksu i meduli (Heyman et al., 2013; Palm et al., 2003). Budući da mikroelektrode kiseonika mjere prosječnu napetost parenhima kisika, očekuje se širi raspon kod bolesnih bubrega. Intracelularna tenzija kiseonika smanjena je na nula mmHg u modelu ishemijskog bubrega čija su lateralna bubrežna arterija i vena stegnute (Hirakawa et al., 2015). Uzimajući u obzir ove nalaze, opseg napetosti kiseonika na HIF prstenu, otprilike 4-20 mmHg, činio se vjerodostojnim in vivo.

Nadalje smo otkrili da pH utječe na formiranje HIF prstena, kao i na napetost kisika. Pošto su tubularne epitelne ćelije u bubregu kontinuirano izložene mokraćnoj tečnosti, pH tubularnih ćelija treba da bude pod uticajem pH urina. S obzirom na širok raspon pH vrijednosti u urinu, odlučili smo da proučavamo ćelije inkubirane na pH rasponu od 5.0–8,5. Postoje studije o rasponu pH vrijednosti u normalnim bubrezima. Jedna studija je pokazala da je pH korteksa bio 7,39 ± 0.{{10}}8, a medule 7,20 ± {{2{{39} }}}.09, mjereno mikroelektrodama (Burke et al., 1999). Druga studija, koristeći MR slikanje pH vrijednosti, pokazala je pH vrijednosti od 7,3 ± 0.13 i 7.0 ± 0,29 (Raghunand et al., 2003). Prijavljeno je da se bubrežni pH smanjio sa 6,5 ​​na 6,32, te na čak 5,83 u teškom slučaju, na mišjem modelu CKD s acidozom (Pavuluri et al., 2019). Ova zapažanja su pružila dokaze o padu pH i varijaciji u CKD. Međutim, uticaj pH na HIF-1 izazvan hroničnom hipoksijom kod CKD nije dovoljno dobro ispitan. U ovoj studiji, uočen je pomak HIF prstena između pH 6,5 i pH 7,4, pH raspona koji je vjerojatan u CKD. Ovaj rezultat podržava hipotezu da blago smanjenje pH utiče na akumulaciju HIF-1 u CKD. Na osnovu dokaza o padu pH ispod 6,0 ​​u teškim slučajevima CKD, također je potrebno procijeniti fiziološko stanje HIF-1 na nižem pH. Iako je bilo izvještaja da kisela sredina, čak i u normoksiji, stabilizuje HIF-1 , većina ovih izvještaja je istraživala uslove blage kiselosti, preko pH 6,0 (Filatova i sar., 2016; Mekhail i dr., 2004) . U ovom radu smo pokazali supresiju akumulacije HIF-1 u tubularnim ćelijama pri pH 5,0 i slabljenje HIF-1 signala u modelu pokrovnog stakala inkubiranom na pH 5,0. Stoga, smanjenje bubrežnog pH kod CKD in vivo može biti u korelaciji sa nedovoljnom aktivacijom HIF-a, kao i sa uremičnim toksinima u hipoksičnom bubregu, što otežava napredovanje CKD (Tanaka et al., 2013).

Naša studija ima nekoliko ograničenja. Prvo, u području hipoperfuzije, medij kulture bi trebao imati manjak hranjivih tvari, pored prisustva nedostatka kisika i smanjenog pH. Međutim, teško je ocrtati efekte pH, napetosti kiseonika i drugih faktora izazvanih hipoperfuzijom. U tijelu se u organima i stanicama javlja ishemija, patološka hipoperfuzija krvi uzrokovana kombinacijom malo kisika i nutrijenata. Važno je razumjeti razlike između sensiranja hipoksije i sensiranja ishemije. Uprkos poteškoćama u razjašnjavanju biološkog efekta svakog faktora, naš hipoperfuzijski model je fiziološki prihvatljiv, oponašajući patološki status in vivo. Drugo, izrada modela pokrovnog staka zahtijeva vještinu i vježbu, budući da se većina ćelija povremeno odvaja tokom uklanjanja pokrovnog staka, posebno kada se koristi tradicionalna metoda (slika S2a). Ovaj problem zavisi od ćelijske linije koja se koristi. Na primjer, bilo nam je teško primijeniti model pokrovnog stakala na ćelije HEK 293 jer je njihovo prianjanje na pokrovno staklo bilo relativno slabo. Treće, bilo je poželjno minimizirati oštećenje kultiviranih ćelija ispod pokrovnog stakala. Broj oštećenih ćelija se povećavao kako se povećavao period tokom kojeg su bile pokrivene, što pokazuje analiza apoptoze. Utvrdili smo da je 3 h bilo prikladno za procjenu HIF prstena kada se činilo da je statičan, a otprilike samo 10 posto ćelija postalo je apoptotično (slika S11). Četvrto ograničenje bila je poteškoća pričvršćivanja kultiviranih ćelija na pokrovno staklo na ujednačen način u svakom uzorku (slika S2b,c). Razlika u vezivanju između tradicionalne i alternativne metode izrade modela za pokrivanje usana također je mogla utjecati na studiju. Izmjerili smo raspon napetosti kisika ekvivalentan HIF prstenu tehnikom fosforescencije vijeka trajanja, u kojoj smo kreirali model pokrovnog stakala koristeći tradicionalnu metodu. Budući da je HIF prsten tokom imunocitohemije vizualiziran korištenjem alternativne metode, prava tenzija kisika može biti drugačija. Minimizirali smo ove greške korištenjem dokaza da je pimonidazol bio pozitivan na 10 mmHg ili manje napetosti kisika. Peto ograničenje je da intracelularni pH nije nužno isti kao pH medija za kulturu. Nekoliko ranijih izvještaja pokazalo je da je unutarćelijski pH u određenoj mjeri u skladu sa pH medija u kultivisanim ćelijama (Michl et al., 2019), mogli bismo procijeniti samo trend unutarćelijskog pH promjenom pH medija. In vivo, odnos između pH intracelularnih i ekstracelularnih regiona, kao što su urin ili telesna tečnost, je složeniji nego u kultivisanim ćelijama. Stoga će daljnja istraživanja o načinu na koji pomak pH reguliše akumulaciju HIF-1 proteina in vivo biti neophodna za budućnost.

Prednost Cistanchea: poboljšati bubregfunkcija

Drugo ograničenje je da pH treba da utiče na marker hipoksije, pimonidazol. Uporedili smo udaljenost ruba pimonidazol pozitivnog područja od centra pokrovnog staka pod različitim pH uvjetima u našem modelu pokrovnog stakala. Rub pimonidazol-pozitivnog područja bio je uporediv između pH 6,5, 7,4 i 8,5 (Slika S12a,b). Prethodna studija je također pokazala održavanje vezivanja pimonidazola pri različitim pH vrijednostima (Kleiter et al., 2006). Na osnovu ovih dokaza, zaključili smo da je pimonidazol odgovarajući marker hipoksije za naše eksperimente s pokrovnim stakalcima. Konačno ograničenje je da s obzirom na raspon napetosti kisika između približno 4 mmHg i 20 mmHg (0,52 posto O2 do 2,6 posto O2) HIF prstena, Pt(II)- i Pd(II)-porfirini, koji se široko koriste kao biološki kisikove sonde, imaju prednosti za mjerenje vrlo niskih koncentracija kisika zbog znatno dužeg vijeka fosforescencije u usporedbi s onima koje koriste Ir(III) komplekse (Yoshihara et al., 2017). Međutim, općenito, kvantitativno mjerenje kisika zasnovano na fosforescenciji, izračunato korištenjem Stern-Volmerove jednačine, ima bolje performanse pri niskim rasponima O2 (Papkovsky & Zhdanov, 2016). Nekoliko prethodnih studija pokazalo je mjerenje napetosti kisika na bazi Ir(III) na niskim čak 10 mmHg (Akiyama et al., 2018; Yoshihara et al., 2015). Stoga vjerujemo da bi raspon napetosti kisika HIF prstena trebao biti precizan rezultat.

5|ZAKLJUČCI

Ukratko, otkrili smo da je razumijevanje uloge kisika i pH ključno za razumijevanje fiziološkog stanja HIF-1 kod CKD-a, a može se steći istraživanjem tubularnih ćelija sa hipoperfuzijom. Model pokrovnog stakala, sa svojim ograničenjima priliva medija, bio je dobar model hipoperfuzije in vivo, posebno u tubulima u CKD, budući da je razrjeđivanje peritubularnih kapilara glavni znak CKD (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Ovaj hipoperfuzijski model također može oponašati gradijente kisika i pH in vivo, kao što su tumori i ishemijske lezije. Model pruža obećavajući pristup razjašnjavanju ovih bioloških mehanizama.

SUKOB INTERESA

Svi autori nemaju sukob interesa za izjavu.

DOPRINOSI AUTORA

Svi autori su doprinijeli formiranju cjelokupnog koncepta. TH je izvršio sveukupne eksperimente. TH i YH su analizirali rezultate i napravili brojke. TH je napisao originalni rukopis. KM, TY i ST su izveli eksperiment koristeći tehniku ​​trajanja fosforescencije i uredili dio rukopisa. YH, TT i MN su uredili cjelokupni rukopis. Svi autori su pročitali i odobrili konačni rukopis.

REFERENCE

Akiyama, H., Takahashi, I., Shimoda, Y., Mukai, R., Yoshihara, T., & Tobita, S. (2018). Ir(iii) kompleksna slika kiseonika živih ćelija i očnog dna sa ICCD kamerom sa gatedom. Fotohemijske i fotobiološke nauke, 17(6), 846–853.

Akizawa, T., Nangaku, M., Yamaguchi, T., Arai, M., Koretomo, R., Maeda, K., Miyazawa, Y., & Hirakata, H. (2019). Enarodustat, terapija konverzije i održavanja za anemiju kod pacijenata na hemodijalizi: randomizirano, placebom kontrolirano ispitivanje faze 2b praćeno dugotrajnim ispitivanjem. Nefron, 143(2), 77–85.

Ameri, K., Burke, B., Lewis, CE, & Harris, AL (2002). Regulacija VL30 elementa pacova u ćelijama raka dojke kod ljudi u hipoksiji i anoksiji: Uloga HIF-1. British Journal of Cancer, 87(10), 1173–1181.

Asai, H., Hirata, J., Hirano, A., Hirai, K., Seki, S., & Watanabe-Akanuma, M. (2016). Aktivacija receptora aril ugljovodonika posreduje u supresiji ekspresije eritropoetina zavisne od faktora izazvane hipoksijom indoksil sulfatom. American Journal of Physiology. Cell Physiology, 310(2), C142–C150.

Burke, TJ, Malhotra, D., & Shapiro, JI (1999). Faktori koji održavaju pH gradijent unutar bubrega: uloga vaskularne arhitekture. Kidney International, 56(5), 1826–1837.

Carrera, S., Senra, J., Acosta, MI, Althubiti, M., Hammond, EM, de Verdier, PJ, & Macip, S. (2014). Uloga HIF-1alfa faktora transkripcije u povećanju diobe ćelija kod fizioloških tenzija kiseonika. PLoS One, 9(5), e97938.

Chen, N., Hao, C., Peng, X., Lin, H., Yin, A., Hao, L., Tao, Y., Liang, X., Liu, Z., Xing, C., Chen, J., Luo, L., Zuo, L., Liao, Y., Liu, BC, Leong, R., Wang, C., Liu, C., Neff, T., … Yu, KHP (2019. ).

Roxadustat za anemiju kod pacijenata sa bubrežnom bolešću koji nisu na dijalizi. New England Journal of Medicine, 381(11), 1001–1010.

Chen, N., Qian, J., Chen, J., Yu, X., Mei, C., Hao, C., Jiang, G., Lin, H., Zhang, X., Zuo, L., He, Q., Fu, P., Li, X., Ni, D., Hemmerich, S., Liu, C., Szczech, L., Besarab, A., Neff, TB, … Valone, F.

H. (2017). Faza 2 studije inhibitora prolil hidroksilaze FG-4592 faktora izazvanog oralnom hipoksijom za liječenje anemije u Kini. Nefrologija, dijaliza, transplantacija, 32(8), 1373–1386.

Chiang, CK, Tanaka, T., Inagi, R., Fujita, T., & Nangaku, M. (2011). Indoksil sulfat, reprezentativni uremični toksin, potiskuje proizvodnju eritropoetina na HIF-ovisan način. Laboratorijska istraživanja, 91(11), 1564–1571.

Chun, WJ, Nah, DY, Bae, JH, Chung, JW, Lee, H., & Moon, IS (2015). Otopina glukoza-inzulin-kalijum štiti ventrikularne miocite novorođenih pacova u in vitro modelu ishemije/reperfuzije pokrovnog stakla. Korean Circulation Journal, 45(3), 234–241.

Coyne, DW, Goldsmith, D., & Macdougall, IC (2017). Nove opcije za anemiju hronične bolesti bubrega. Kidney International Supplement, 7(3), 157–163. kiss.2017.09.002

Deng, A., Arndt, MA, Satriano, J., Singh, P., Rieg, T., Thomson, S. et al (2010). Zaštita bubrega kod kronične bolesti bubrega: aktivacija faktora izazvanog hipoksijom naspram blokade angiotenzina II. American Journal of Physiology. Renal Physiology, 299(6), F1365–F1373.

Filatova, A., Seidel, S., Bogurcu, N., Graf, S., Garvalov, BK, & Acker, T. (2016). Acidoza djeluje kroz HSP90 na Ph.D./VHL nezavisan način kako bi promovirao HIF funkciju i održavanje matičnih stanica u gliomu. Istraživanje raka, 76(19), 5845–5856. MOŽE-15-2630

Goldfarb, M., Rosenberger, C., Abassi, Z., Shina, A., Zilbersat, F., Eckardt, KU, Rosen, S., & Heyman, SN (2006). Akutno-kronično zatajenje bubrega kod pacova: funkcionalna kompenzacija i tolerancija na hipoksiju. American Journal of Nephrology, 26(1), 22–33.

Heyman, SN, Rosenberger, C., Rosen, S., & Khamaisi, M. (2013). Zašto je dijabetes melitus faktor rizika za nefropatiju izazvanu kontrastom? BioMed Research International, 2013, 123589.

Hirakawa, Y., Mizukami, K., Yoshihara, T., Takahashi, I., Khulan, P., Honda, T., Mimura, I., Tanaka, T., Tobita, S., i Nangaku, M. (2018). Intravitalna fosforescentna slika korteksa bubrega precizno mjeri hipoksiju bubrega. Kidney International, 93(6), 1483–1489.

Hirakawa, Y., Tanaka, T., i Nangaku, M. (2017). Hipoksija bubrega u CKD; Patofiziologija i metode otkrivanja. Granice u fiziologiji, 8, 99.