Kružni mehanizam koji povezuje prošlo i buduće učenje kroz promjene u percepciji, 2. dio

Razjašnjavanje kontrolnog kruga koji pokreće promjenu percepcije

Zatim, da bismo okarakterisali mehanizme kola koji posreduju ovu promenu percepcije izazvanu učenjem, izmerili smo aktivnost u dva interneurona višeg reda, cerebralnom ventralnom 1a (CV1a) i neuronu koji preokreće obrazac (PRN). Ove ćelije su neuroni nalik na komande u krugovima za ingestiju i egesciju i, kada su aktivne, dovoljne su da pokreću svoje motoričke programe (16, 31). Intracelularni snimci su pokazali da je aktivnost CV1a značajno povećana 4 sata nakon jakog treninga u odnosu na naivne životinje, dok je aktivnost PRN značajno smanjena (Slika 3, A do E).

Perceptivna promjena je promjena u načinu razmišljanja i prilagođavanje mentaliteta. Uključuje svijest o okruženju, svijest o vlastitom identitetu, razumijevanje ličnih iskustava i težnju ka ciljevima i težnjama. Perceptivne promjene mogu potaknuti ljude da zauzmu pozitivniji pristup životu i bolje se nose s izazovima. A ovaj pozitivan stav i mentalitet mogu poboljšati pamćenje ljudi.

Prvo, promjena u percepciji omogućava ljudima da se više fokusiraju na pozitivne stvari u svom životu. Kako kaže "Tražimo optimistična lica", često u životu ima mnogo pozitivnih faktora, ali ih često ne otkrijemo. A kroz promjene u percepciji, možemo biti jasnije svjesni ovih pozitivnih faktora i posvetiti im dovoljno pažnje i značaja. Ovi optimistični faktori ne samo da mogu akumulirati našu sreću, već nas i potaknuti da bolje shvatimo informacije u životu, čime se poboljšava pamćenje.

Drugo, promjena percepcije također može pomoći ljudima da bolje razumiju sebe, uključujući svoje snage, slabosti, vrijednosti itd. Ovo produbljivanje samosvijesti omogućava ljudima da bolje upravljaju svojim emocijama i stresom i postanu motiviraniji da slijede svoje ciljeve i želje. Ova vrsta ambicije i motivacije može potaknuti ljudski mozak da bude kreativniji i razmišljajući, te dodatno poboljšati njihovo pamćenje.

Konačno, promjene u percepciji također mogu navesti ljude da posvete više pažnje vlastitim iskustvima i rastu. Bilo da se radi o uspjehu ili neuspjehu, svako iskustvo je vrijedna prednost. Kroz promjene u percepciji, možemo bolje reflektirati i sumirati, ne samo bolje otkriti svoje točke rasta i nedostatke, već i bolje apsorbirati i zapamtiti iskustva i lekcije.

Ukratko, promjena u percepciji, iako jednostavno mentalno prilagođavanje, može imati duboko pozitivan utjecaj na naše živote i učenje. Sa pozitivnim i sunčanim stavom, možemo se bolje nositi s izazovima, težiti rastu i bolje savladati informacije i zapamtiti sadržaj. Aktivno investirajmo u transformaciju percepcije i kontinuirano poboljšavamo svoj rast i kvalitet. Vidi se da moramo poboljšati svoje pamćenje. Cistanche deserticola može značajno poboljšati pamćenje, jer Cistanche deserticola može regulisati i ravnotežu neurotransmitera, kao što je povećanje nivoa acetilholina i faktora rasta. Ove supstance su veoma važne za pamćenje i učenje. Osim toga, meso također može poboljšati protok krvi i promovirati isporuku kisika, što može osigurati da mozak dobije dovoljno hranjivih tvari i energije, čime se poboljšava vitalnost i izdržljivost mozga.

Kliknite znati načine za poboljšanje funkcije mozga

Zaključili smo da se ovaj odnos antagonističke aktivnosti vođen učenjem može objasniti zajedničkim motivom kola, naime, inhibicijom između konkurentskih kola (32). U ovom scenariju, pojačana regulacija aktivnosti u jednoj mreži poslužila bi za potiskivanje u antagonističkoj. U prilog tome, CV1a prima velike inhibicione inpute tokom faze protrakcije tokom i spontanih i PRN-vođenih ciklusa egescije (slika 3F). Ovi inhibicijski ulazi nisu proizašli direktno iz PRN, što sugerira da su neuroni nizvodno regrutovani.

Fig. 2. Previous learning alters the perception of future training by shifting the feeding network state. (A) Example frames showing mouth movements during ingestion or egestion. Frames are color-matched to (B) (red: ingestion, blue: egestion). White dots indicate the distal tip of the radula tracked during bite classification. Scale bar, 0.5 mm. (B) Heat plots of radula movements during the first 15 bites in response to the CS + US during weak training in animals receiving weak training only versus animals receiving vital training 4 hours earlier. Red-white-blue lookup table represents radula movements. Positive (blue) is egestion; negative (red) is ingestion. (C) Statistical summary of (B) shows a significant change in the mean difference in radula movements between conditions (two-tailed t-test, P < 0.01, t = 3.1). (D) The plot of the fraction of ingestion/egestion bites produced during weak training shows a significant difference between conditions(Fisher's exact test, P < 0.01). (E) The plot of fraction of animals performing no egestion bites versus >{{0}} ugriza egestiona pokazuje značajnu razliku između stanja (Fisherov egzaktni test, P < 0,001). (F) Aktivnost B11 i N2v u in vitro preparatu tokom ciklusa ingestije i gestije. B11 je pretežno aktivan u fazi retrakcije tokom ingestije i fazi protrakcije tokom egescije.

N2v activity does not change during ingestion and egestion cycles. B11 is therefore a readout of ingestion versus egestion. Gray lines represent the retraction phase onset. (G) Heat plots of B11 activity during fictive feeding cycles. Lookup table colors are normalized B11 spike differences. Positive (blue) is egestion; negative (red) is ingestion. (H) Statistical summary of (G) shows a significant change in the 11 spike difference between conditions (Mann-Whitney test, P < 0.01, U = 70). (I) The plotof fraction of ingestion/egestion cycles shows a significant difference between conditions (Fisher's exact test, P < 0.001). (J) The plot of the fraction of preparations producing no egestion cycles versus >{{0}} ciklusi preuzimanja pokazuju značajnu razliku između uslova (Fisherov egzaktni test, P < 0,001). h, sati.

Zatim, da identifikujemo izvor ovih ulaza, izvršili smo opsežnu pretragu za tipom neurona koji bi ispunjavao sljedeće kriterije: (i) trebao bi inhibirati CV1a kada je aktivan, (ii) trebao bi biti aktivan tokom faze protrakcije egescije ciklusa, i (iii) treba da bude pobuđen PRN aktivnošću. Koristeći pristup označavanja fluorescencije kako bismo otkrili neurone koji izlaze iz bukalnih ganglija gdje je smještena većina strujnih kola (33), identificirali smo jedan tip neurona kandidata, prekidač uzorka 1 (PS1) (slika 4A), koji je zadovoljio sva tri kriterija . Prvo, veštačka stimulacija PS1 monosinaptički je inhibirala ipsilateralni CV1a (slika 4, B i C). Drugo, ovaj neuron je bio jako aktivan tokom faze protrakcije i ciklusa egescije vođenih PRN-om i stimulansom (sl. 4D i fsl.S9A) kada je CV1a bio inhibiran. Treće, aktivnost PRN pobuđuje PS1 monosinaptički, posmatrano kao ekscitatorni postsinaptički potencijali (EPSP) 1:1 (Slika 4, E i F). Da bismo utvrdili da li je PS1 bio jedini izvor inhibicije CV1a tokom ponašanja hranjenja egescijom, umjetno smo manipulirali njegovom aktivnošću tokom ciklusa vođenih PRN-om. Kada je bila hiperpolarizovana, sada je došlo do značajnog povećanja aktivnosti CV1a (slika 4, G i H) bez dokaza za fazne inhibitorne sinaptičke inpute koje normalno prima. Štaviše, hiperpolarizacija PS1 je takođe bila dovoljna da poveća aktivnost CV1a tokom ciklusa egescije vođenih senzorima (slika S9B). Stoga, ovaj ključni inhibitorni tip neurona djeluje kao prekidač tokom odabira akcije, sprječavajući ometajuću aktivaciju komandnih centara ingestije tokom egescije.

Kako CV1a nema monosinaptičku vezu sa PRN-om, kako osigurava supresiju egescije kada je aktivan? Bili smo u mogućnosti da odgovorimo na ovo pitanje identifikacijom druge komponente kontrolnog kola: bukalnog interneuronskog tipa, PS2, koji je bio snažno električno povezan sa PRN i dovoljan da pokrene robusne cikluse egescije (sl. S9, C i D). Prima snažnu olakšavajuću inhibiciju od CV1a i tako dovodi do supresije gutanja kada se generišu ciklusi ingestije (sl. S9, E i F). Štaviše, veštačka aktivacija PS2 izazvala je polisinaptičke inhibitorne inpute na CV1a, koji su nastali kroz njegovu monosinaptičku ekscitatornu vezu na PS1 (sl. S9, G i H). Zajedno, ovi rezultati pokazuju da se međusobna inhibicija koristi za sprečavanje aktivacije konkurentskih kola i da ovaj motiv kola pruža kontrolnu tačku na koju bi plastičnost mogla djelovati (fFigS9I). Zatim smo istražili moguću ulogu potiskivanja egestivnog kruga u pristranosti percepcije događaja učenja.

Manipulacija perceptivnim kontrolnim krugom omogućava novo učenje in vivo

S obzirom na to da favorizira izražavanje ponašanja egestije, zaključili smo da bi smanjenje aktivnosti PRN → PS1 moglo biti dovoljno da promijeni percepciju životinje o slabom treningu i tako poboljša stjecanje pamćenja. Da bismo to istražili, razvili smo farmakološku strategiju koja nam je omogućila da manipulišemo izlaznim putem PRN. Ranije smo pokazali da je ovaj neuron dopaminergičan i da je blokator D2 receptora, sulpirid, veoma efikasan u inhibiciji njegovog delovanja na motoneurone sledbenika (16). Ovdje smo potvrdili da je veza PRN → PS1 također osjetljiva na sulpirid (slika 5, A i B), što uzrokuje značajno smanjenje amplitude PRN → PS1 EPSP. Zatim smo testirali da li blokiranje ove veze može oponašati povećanje aktivnosti CV1a uočeno 4 sata nakon snažnog treninga. Otkrili smo da je sulpirid izazvao snažno povećanje aktivnosti CV1a ciklusa u odnosu na prethodni tretman (Slika 5, C i D), što je u skladu s našim prethodnim radom koji pokazuje da primjena sulpirida pristrasno utiče na aktivnost prema događajima gutanja (16). Dakle, sulpirid može snažno promijeniti stanje mreže, zamjenjujući efekte jakog treninga. Kao takav, ovaj agens pruža priliku da se in vivo testira da li ovaj put leži u osnovi izmijenjene percepcije životinje o slabom treningu. Životinjama je ubrizgan sulpirid ili normalni fiziološki rastvor i podvrgnuti su protokolu slabe obuke sa odgovorima na hranjenje izmerenim kao na slici 2 (A i B). Otkrili smo da životinje kojima je ubrizgan sulpirid izvele značajno više događaja gutanja kao odgovor na slab trening nego životinje koje su ubrizgane fiziološkom otopinom (Slika 5, E do G), a značajno više životinja kojima je ubrizgan sulpirid uopće nije reagovao na egestiju (Sl. 5H). Štaviše, došlo je do značajnog smanjenja vjerovatnoće prijelaza između stanja nakon injekcije sulpirida (sl. S10, A u D). Stoga, i intenzivan trening i injekcija sulpirida mijenjaju stanje mreže in vitro i stabiliziraju percepciju slabog treninga in vivo.
Zatim smo testirali da li je promjena percepcije izazvana sulpiridom dovoljna za stjecanje LTM nakon slabog treninga, kao što smo pokazali u slučaju jakog treninga. Životinjama je ubrizgan sulpirid ili fiziološki rastvor, a zatim su prošli slabu obuku sa LTM testiranim 1 dan kasnije. U skladu sa efektima jakog treninga, otkrili smo da životinje kojima je ubrizgan sulpirid prije slabog treninga imaju značajno veći odgovor na GNL u poređenju sa obučenim životinjama koje nisu primile ili su injektirane slanim rastvorom (slika 5I). Nadalje, injekcija sulpirida u odsustvu slabog treninga nije povećala odgovor hranjenja na GNL kada je testirana 1 dan kasnije (slika 5I). Stoga, farmakološki manipuliranje stanjem mreže uzrokuje promjenu percepcije slabog treninga koja je dovoljna da životinja stekne i potpuno konsolidira pamćenje.

Zatim smo ispitali da li je identificirana promjena stanja mreže izazvana učenjem nakon vitalnog treninga bila uključena u izražavanje izvornog snažnog pamćenja ili je to bio paralelni proces koji je služio u svrhu poboljšanja budućih događaja učenja. Da bismo to testirali, ubrizgali smo životinjama sulpirid ili fiziološku otopinu i zabilježili njihov odgovor na jak trening CS (AA), ali u nedostatku prethodne vitalne obuke. Pretpostavili smo da ako je promjena stanja mreže izazvana učenjem uključena u ekspresiju originalne memorije, tada bi se ponašanje hranjenja kao odgovor na CS (AA) koji se koristi za intenzivan trening povećalo umjetnim izazivanjem iste promjene u mreži. stanje sa sulpiridom, ali u nedostatku prethodne vitalne obuke. Međutim, otkrili smo da injekcija sulpirida nije izazvala povećanje odgovora na AA u poređenju sa životinjama koje nisu primile fiziološku otopinu (slika 5J). Stoga, iako vitalni trening uzrokuje promjenu stanja mreže, ova promjena izazvana učenjem ne učestvuje aktivno u izražavanju samog jakog pamćenja, što sugerira da su uključeni različiti mehanizmi. Zajedno, ovi rezultati pokazuju da snažno učenje uzrokuje paralelne promjene u neuralnoj aktivnosti: jednu za izražavanje samog pamćenja i jednu za promjenu percepcije budućeg apetitivnog učenja.

Promjene u percepciji povezane s pamćenjem generaliziraju se na alternativnu paradigmu treninga

Koju ulogu ima mehanizam koji je ovdje identificiran? Sposobnost povezivanja jakih i slabih događaja učenja koji su blisko vremenski povezani sugerira da bi Lymnaea mogla koristiti ovu sposobnost za identifikaciju perioda "bogatih učenjem", na primjer, kompatibilnih s dolaskom životinje u bogato okruženje. Ako je tako, očekivali bismo da učenje treba generalizirati, a ne ovisiti o istom SAD-u i za jake i za slabe treninge. Da bismo testirali ovu važnu ideju, izveli smo eksperimente u kojima smo zamenili saharozu koja se koristi u protokolu slabog treninga sa L-serinom (slika 6A), poznatim alternativnim stimulusom apetita u Lymnaei (29). Dakle, i CS i US se razlikuju u dvije različite paradigme treninga. Otkrili smo da, iako samo uparivanje GNL + L-serin nije dalo uslovljeni odgovor, uočen je snažan 1-dnevni memorijski izraz za GNL ako mu je prethodio jak trening (slika 6B). Dakle, memorijsko izražavanje nije ograničeno na jedan SAD, već umjesto toga može omogućiti formiranje različitih asocijacija, što sugerira da bi bilo vrlo prikladno za omogućavanje generaliziranog snižavanja praga za formiranje novih sjećanja.

DISKUSIJA

Sposobnost učenja novih asocijacija ključna je za opstanak u nepredvidivom okruženju. S obzirom da su akvizicija i konsolidacija pamćenja energetski skupi procesi (1, 2, 34), postoje ključne potencijalne prednosti u korištenju strategija koje pomažu u donošenju odluka o tome šta i kada naučiti. Ovdje identificiramo jednostavan mehanizam u Lymnaei pomoću kojeg se prošli događaji koriste za pristrasnu percepciju. Značajno, također pokazujemo da ovaj mehanizam može voditi buduće učenje — olakšavajući stjecanje pamćenja za asocijacije koje bi ranije bile ignorisane — i razjašnjavamo odgovorna neuronska kola. Predlažemo da ovo služi da upozori životinju da efikasno usmjeri resurse na novo učenje gdje nedavno iskustvo sugerira da može postojati posebna prednost u formiranju pozitivnih asocijacija.

Ključna karakteristika mehanizma koji razjašnjavamo je da snažno učenje pokreće paralelne procese u mozgu: jedan za izražavanje originalnog pamćenja, a drugi za promjenu percepcije budućih događaja učenja i olakšava stjecanje novog pamćenja. Čini se da su oni nezavisni jer pomak u stanju neuronske mreže izmjeren nakon snažnog treninga nije dovoljan za izražavanje originalnog pamćenja, o čemu svjedoči odsustvo lažnog pamćenja kada se stanje mreže farmakološki promijeni. Slični paralelni putevi su identificirani u eksperimentima kondicioniranja na miševima. Na primjer, u zadatku olfaktorne diskriminacije, opsežna obuka promijenila je ekscitabilnost piramidalnih neurona u piriformnom korteksu poklapajući se s poboljšanom sposobnošću učenja novih zadataka (učenje pravila), ali to nije bilo u korelaciji s ekspresijom izvorne memorije (35 , 36). Kao takve, iako ove promjene izazvane učenjem nisu dio "engrama" koji izražava pamćenje, one ipak služe kritičnim adaptivnim funkcijama kod životinja, omogućavajući im da koriste svoja prošla iskustva da vode svoje buduće ponašanje - proces koji je nedvojbeno važan kao i prisjećanje. samog pamćenja.

Mehanizam koji smo identifikovali pokazuje ključne vremenske karakteristike. Omogućava poboljšane sposobnosti učenja od 30 minuta do 4 sata nakon snažnog treninga, što sugerira da je stjecanje novog pamćenja olakšano u kritičnom vremenskom periodu. Na osnovu našeg prethodnog rada, ovaj vremenski okvir je usklađen sa pojavom srednjeročne memorije za jak trening i traje do pojave LTM (17). Ekspresija ove memorije u ovom vremenskom okviru zavisi od sinteze proteina, dok memorijski trag snimljen u kraćoj, 10-min vremenskoj tački nije (17). Ovo snažno sugerira da je promjena stanja mreže identificirana u našoj sadašnjoj studiji također ovisna o sintezi proteina, objašnjavajući izostanak efekta 10 minuta nakon snažnog treninga. Nadalje, poboljšana sposobnost učenja se ne održava u dužim vremenskim tačkama: formiranje slabe memorije za učenje izostaje od ~6 sati nadalje, iako je izvorno snažno pamćenje i dalje prisutno i izražajno. Stoga je pomak u mrežnom stanju izazvan učenjem prolazno izazvan i ne nadživljava molekularne mehanizme za koje se zna da su neophodni za konsolidaciju originalne memorije tokom prvih 6 sati nakon snažnog treninga (37). Pretpostavljamo da bi trajni pomak u percepciji zbog prošlih učenja mogao biti štetan za životinju, dovodeći do energetski skupih i potencijalno neprilagođenih sjećanja. Takođe postoji zahtjev za strogim vremenskim nizom jakog praćenog slabim treningom. Ovo se razlikuje od prethodno identificiranog procesa, bihevioralnog označavanja (38, 39), koji olakšava interakciju i poboljšanje sjećanja na osnovu sinaptičkih oznaka i hvatanja (40, 41). Tokom bihevioralnog označavanja, oznaka koju pokreće slab događaj učenja cilja se i poboljšava jakim događajem učenja bez obzira na vremenski slijed dva događaja učenja (42, 43).

Ova ključna karakteristika označavanja ponašanja dovodi do promjene sjećanja na događaj, a ne na sam događaj učenja. Nasuprot tome, pomak u percepciji izazvan učenjem koji ovdje identificiramo vodi životinju da odluči o kojim budućim događajima da uči, a ne o tome koja nedavno stečena sjećanja treba dalje konsolidirati. Kao takvi, iako ova dva mehanizma imaju neke paralele i oba služe za povećanje broja konsolidiranih dugoročnih sjećanja, oni funkcioniraju u različitim okolnostima i koriste različite mehanizme kola. Također pokazujemo da se promjena percepcije uzrokovana učenjem generalizira na druge oblike apetitivnog učenja budući da bi drugi tip treninga sa slabim apetitom također mogao biti poboljšan prošlim snažnim učenjem. Slično generalizirano poboljšanje sposobnosti učenja pronađeno je kod miševa, gdje se smatra da učenje o olfaktornoj diskriminaciji ovisno o hipokampusu prebacuje hipokampalnu mrežu u "način učenja", poboljšavajući druge vrste obrazovanja ovisnog o hipokampusu, kao što je prostorno učenje (44 ). Vremenski tok i nespecifična priroda mehanizma identificiranog u Lymnaei mogu poslužiti da upozore životinju na period "bogat učenjem" koji bi omogućio stvaranje pozitivnih asocijacija na znakove koji bi, ako se nađu u izolaciji, vjerovatno bili zanemareni.

Koji mehanizam olakšava slab trening nakon jakog treninga? Primjećujemo da su naivne životinje izložene slabom treningu "flip-flop" ili prijelazu između ponašanja gutanja i egestije, što sugerira da životinja ima bistabilnu percepciju CS + US podražaja tokom treninga, što predstavlja period nejasnoće ( 45). Primjetno, također nalazimo da jak trening dovodi do predrasuda i stabilizira percepciju životinje o slabom treningu kako bi favorizirao ponašanje pri gutanju. Predlažemo da je bistabilna percepcija tokom slabog treninga emergentno svojstvo relativne aktivnosti ingestijskih i egestivnih krugova jer isto prebacivanje traje in vitro u odsustvu bilo kakve vanjske stimulacije. Karakterizirajući povezanost između dva kola, pokazujemo da su kompetitivne interakcije posljedica motiva kola recipročne inhibicije (32, 46), što sugerira da je odabir akcije vjerovatno generiran modelom pobjednik uzima sve. Inhibicija unaprijed iz egestivnog kruga sprječava koaktivaciju kruga za ingestiju (PRN + PS2 → PS1 → CV1a), dok kolo za ingestiju direktno inhibira dio električno spregnutog egestivnog kruga (CV1a → PS2) (Sl. 6C i Slika S9I).

Budući da su oba kola inervirana istim generatorom centralnog uzorka koji napaja jezgro (16, 31), predlažemo da izraz ciklusa diktira prvi krug kako bi se dostigao dovoljan prag brzine skokova da inhibira drugi. Nakon snažnog treninga, dolazi do pomaka u relativnoj aktivnosti dva kruga i, kao takav, izraženost ciklusa gutanja je dominantna (slika 6C). Sličan motiv kola se vidi tokom uslovljavanja straha kod miševa, gdje se može stvoriti jedno od dva nekompatibilna ponašanja: bijeg ili smrzavanje. Učenje pomera ravnotežu dve recipročno inhibitorne klase neurona u centralnoj amigdali, što dovodi do pristrasnosti izražavanja prema jednom ili drugom ponašanju (47). U Lymnaei, međutim, promjena aktivnosti izazvana učenjem se ne koristi za izražavanje pamćenja, već radije za olakšavanje novog učenja (slika 6C). Pokazali smo da je farmakološka stabilizacija kruga ingestije blokiranjem inhibicije naprijed iz egestivnog kruga dovoljna da promijeni percepciju životinje o CS + US tokom slabog treninga in vivo. Nadalje, pokazujemo da ovo može zamijeniti stjecanje jake memorije, pomjerajući stanje mreže kako bi se omogućile nove pozitivne asocijacije, sugerirajući da se formiranje sjećanja može olakšati smanjenjem dvosmislenosti tokom događaja učenja. Prethodne studije na ljudima pokazale su da prethodno učenje može promijeniti kontrolu pažnje, koja podešava perceptivnu osjetljivost (3-5), a pokazalo se i da pažnja ima ulogu u perceptivnoj multistabilnosti (45, 48).

Iako je u ovoj studiji izmjereno samo perceptivno očitavanje životinje, moguće je da mehanizam koji je ovdje identificiran uključuje i promjenu pažnje koja bi mogla modulirati percepciju slabog treninga. Činjenica da je promjena u stanju mreže prisutna prije izlaganja slaboj obuci mogla bi sugerirati da postoji mehanizam anticipativne pažnje koji, zauzvrat, podešava percepciju budućih događaja učenja. Međutim, ako se radi o takvom pomaku pažnje, on je u stanju samo da modulira percepciju i na taj način poboljša formiranje nove memorije od ~30 minuta nakon snažnog treninga.

Zašto stabilizacija mreže prema događajima gutanja olakšava slabu obuku? Jedno jednostavno objašnjenje je da, tokom gutanja, životinja aktivno uvlači CS i US u bukalnu šupljinu, a zatim u jednjak, omogućavajući svakom da se proguta. Ovo je u suprotnosti sa egescijom gdje se sadržaj efikasno izbacuje iz bukalne šupljine. Raniji rad je pokazao da uspješno in vitro kondicioniranje ovisi o tome da US dospijeva do jednjaka (17) i aktivira neurone jednjaka (49), koji pojačavaju CS preko aktivacije D1 receptora u neuronima sljedbenika (50-52). Stoga će favoriziranje ciklusa ingestije poslužiti povećanju dosezanja i aktivacije ovih neurona u SAD, čime će se ojačati CS + US.

Ovdje smo otkrili do sada neprijavljen mehanizam pomoću kojeg promjene u percepciji mogu spojiti prethodno i novo učenje pod određenim uvjetima i vremenskim okvirima. Predlažemo da ovo može poslužiti kao opći mehanizam za uspostavljanje stanja, omogućavajući životinji da formira asocijacije između novih kombinacija podražaja, koji, u izolaciji, ne bi bili dovoljni da izazovu pamćenje. Budući da su veze između učenja i perceptivnih promjena dobro uspostavljene kod viših životinja, uključujući ljude, predlažemo da put učenja → percepcija → učenja može biti široko očuvana karakteristika koja zaslužuje dalju pažnju u studijama učenja. S obzirom na to da je formiranje LTM-a povezano sa povećanim energetskim troškovima – posebno angažovanjem i angažovanjem molekularne mašinerije za konsolidaciju memorije – mehanizam koji usmerava učenje ima potencijalno važnu vrednost za preživljavanje. U slučaju životinje koja se hrani kao što je Lymnaea, koja radi sa malim energetskim budžetom (53), učenje različitih asocijacija je vrlo korisno, upozoravajući ih na potencijalne izvore hrane ili moguće opasnosti u njihovoj okolini, ali to treba biti uravnoteženo s energetskim troškovi konsolidacije tih sjećanja. Ovaj mehanizam im stoga omogućava da svoje buduće učenje podese na uspjeh u učenju iz prošlosti, efektivnim snižavanjem praga potrebnog za učenje novih asocijacija.

MATERIJALI I METODE

Održavanje životinja

Životinje su držane u grupama u velikim rezervoarima koji su sadržavali vodu bez Cu2+- na 20 stepeni na 12-satnom svjetlu/12-satnom tamnom režimu. Životinje su hranjene zelenom salatom tri puta sedmično i ribljom hranom na bazi povrća (Tetra-Phyll; TETRA Werke, Melle, Njemačka) dva puta sedmično. Životinje su prebačene u manje rezervoare i bez hrane 2 dana prije eksperimenta. Za sve eksperimente korišteni su odrasli (3 do 4 mjeseca) puževi (Lymnaea stagnalis). Lymnaea je organizam nižih beskičmenjaka (mekušaca) koji ne potpada pod Zakon o životinjama (naučne procedure) iz 1986. (UK). Stoga za ove eksperimente nije bilo potrebno etičko odobrenje ili smjernice.

Apetitivna obuka i procedure testiranja u jednom pokušaju

Snažno kondicioniranje apetita u jednom pokušaju je izvedeno uparivanje AA (0.004%) kao CS sa saharozom ({{10}}.33% ) kao SAD koristeći prethodno dobro opisanu metodu (23, 24). Slabo jednoprobno kondicioniranje apetita izvedeno je uparivanje GNL-a (0.004%) kao CS sa saharozom (0,11%) ili L-serinom (0,11%) kao SAD. U kontrolnom eksperimentu protivteža, jako kondicioniranje je izvedeno uparivanje GNL kao CS sa saharozom (0,33%) kao SAD, a slabo kondicioniranje je izvedeno uparivanje AA kao CS sa saharozom (0,11%) kao SAD. Ukratko, životinje su stavljene pojedinačno u Petrijeve posude koje su sadržavale 90 ml vode bez Cu{20}} na 10 minuta kako bi se aklimatizirale na novo okruženje prije početka procedure treninga. U vodu je dodano 5 mililitara CS, a 30 s kasnije aplicirano je 5 ml US. Životinje su ostavljene u otopini koja je sadržavala CS i US 2 minute, zatim isprane u vodi bez Cu{25} i vraćene u svoje kućne rezervoare. Za testiranje odgovora na CS 1 dan nakon kondicioniranja, životinje iz obučenih i naivnih grupa su prebačene iz njihovih kućnih akvarija u petrijevu posudu napunjenu sa 90 ml vode bez Cu{28}}i ostavljene da se aklimatiziraju 10 minuta.

Potom je u posudu dodano pet mililitara vode i izbrojan je broj odgovora na hranjenje (ugriza) u naredne 2 minute. Zatim je u posudu dodano 5 ml CS, a broj odgovora na hranjenje je prebrojan u naredne 2 minute. CS odgovori su zatim procijenjeni korištenjem "skor razlike" (∆ broj ugriza). Ovo je dobijeno oduzimanjem broja ciklusa hranjenja uočenih tokom 2 minute nakon primjene vode od broja ciklusa hranjenja u 2 minute nakon primjene CS. Tokom eksperimenata dvostrukog kondicioniranja, životinje su dobile i jaku i slabu kondicioniranje apetita odvojeno vremenskim intervalima kako je opisano u rezultatima. Da bismo testirali da li je prethodna izloženost SAD-u korišćena tokom intenzivnog treninga (0.33% saharoze) poboljšala učenje slabog treninga, izveli smo intenzivnu obuku kako je gore opisano, ali u odsustvu prezentacije CS (AA). Životinje su tada dobile slabu obuku GNL-a i saharoze (0.11%) 4 sata kasnije i testirane su na njihov odgovor na GNL 1 dan kasnije.

Merenje percepcije tokom slabog treninga

Učinak prethodnog učenja na percepciju životinje o slabom treningu testiran je izvođenjem vitalnog treninga praćenog slabim treningom 4 sata kasnije, kao što je gore navedeno. Tokom slabe CS + US prezentacije, odgovori životinja na hranjenje su snimljeni (33 kadra/s) odozdo. Smjer kretanja radule i osnovne strukture odontofora mjeren je tokom prvih 15 odgovora na hranjenje kao u (16). Ukratko, pozicija dorzalne mandibule je prvo označena u okviru koji je prethodio prvom kadru u kojem je radula bila vidljiva tokom svakog zagriza pomoću softvera ImageJ. Zatim je praćena radula za cijeli zagriz i izračunata je udaljenost od početne pozicije dorzalne mandibule. Zatim je izmjerena prosječna razlika između okvira. Negativan rezultat je, dakle, predstavljao da su radula i dorzalna donja donja čeljust razdvojene na početku zagriza i da se radula pomera prema dorzalnoj donjoj čeljusti tokom zagriza, dok je pozitivan rezultat predstavljao da su mandibula i radula blizu na početku zagriza. a radula se udaljava kako je ugriz napredovao. Kriterijumi za definiranje da li je odgovor bio gutanje ili ingestija bili su zasnovani na tome da li je razlika u kretanju negativna (gutanje) ili pozitivna (egestija). Kako bi se izmjerilo kako prethodni vitalni trening mijenja stabilnost percepcije CS + US koji se koristi u slabom treningu, analizirani su parovi uzastopnih zalogaja. Stabilan par zalogaja klasifikovan je kao dva ista uzastopna zalogaja (ingest-ingest ili egest-egest). Promjenjivi par zalogaja klasifikovan je kao dva različita uzastopna zalogaja (ingest egest ili egest-ingest).

Vjerojatnosti prijelaza su zatim izračunate brojanjem broja zamjena ugriza izraženog kao dio ukupnog broja parova ugriza. Kako bismo testirali da li je prethodna izloženost SAD-u korištena tokom intenzivnog treninga ({{0}}.33% saharoze) promijenila percepciju slabog treninga, izveli smo intenzivan trening kao što je gore opisano, ali u nedostatku prezentacije CS-a (AA) i izmjereno ponašanje pri gutanju/egestiji kao gore. Da bi se provjerilo da li je prethodni slab trening promijenio percepciju kasnijeg slabog treninga, životinje su prvo primile AA uparen sa 0.11% saharoze, a zatim su njihovi odgovori na ingestiju/egestiju na GNL i 0.11% saharozu bili izmjereno 4 sata kasnije. Da bi se testirali efekti snažnog treninga na reakciju životinje na CS ili US korištene tokom slabog treninga, životinje su dobile intenzivnu obuku kao gore. Četiri sata kasnije, životinje su stavljene u petrijevu posudu sa 90 ml vode bez Cu{8} i ostavljene da se aklimatiziraju 10 minuta. Zatim su primili 5 ml vode i prebrojani su njihovi odgovori na hranjenje. Nakon toga su primili 5 ml ili GNL ili 0,11% saharoze, a odgovori na hranjenje su prebrojani kako bi se broj ∆ ugriza mogao izračunati kao gore.

Preparati i elektrofiziološke metode

Prateći postupke prethodno opisane u (16), izveli smo in vitro eksperimente koristeći izolovani CNS preparat. Mali dio prednjeg jednjaka držan je vezan za CNS pomoću dorzalnih bukalnih nerava. Preparati su perfuzirani normalnim fiziološkim rastvorom koji sadrži 50 mM NaCl, 1,6 mM KCl, 2 mM MgCl2, 3,5 mM CaCl2 i 10 mM Hepes pufera u vodi. Monosinaptičke veze su testirane kupanjem preparata u visokodivalentnom (HiDi) fiziološkom rastvoru, koji povećava prag akcionog potencijala, smanjujući polisinaptičke veze. HiDi fiziološki rastvor je sastavljen od 35.0 mM NaCl, 2 mM KCl, 8.0 mM MgCl2, 14,0 mM CaCl2 i 10 mM Hepes pufera u vodi. Intracelularni zapisi su napravljeni pomoću oštrih elektroda (10 do 40 megoma) ispunjenih sa 3 M KAc i 0,5 mM KCl. Signali su prikupljeni pomoću pojačala NL 102 (Digitimer Ltd.) i Axoclamp 2B (Axon Instrument, Molecular Device), a podaci su prikupljeni korištenjem micro 1401 Mk II interfejsa i analizirani pomoću softvera Spike2 (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK).

Identifikacija neurona

Motoneuron B11 s promjenom faze nalazi se u bukalnim ganglijima i identificiran je na osnovu njegove lokacije, oblika šiljaka, sinaptičkih inputa iz PRN-a i sposobnosti da promijeni obrazac aktivnosti tokom ciklusa ingestije i gestije (16). Interneuron CV1a nalik na komandu ingestije nalazi se u cerebralnim ganglijama i identificiran je po svojim električnim svojstvima, karakterističnoj lokaciji i sposobnosti pokretanja fiktivnih ciklusa hranjenja kada je umjetno depolariziran u vatrene šiljke (31). Interneuron PRN sličan komandi egescije nalazi se u bukalnim ganglijima i identificiran je po svojoj lokaciji i monosinaptičkoj ekscitatornoj vezi s B11. N2v neuron je interneuron centralnog generatora uzorka koji se nalazi na ventralnoj površini bukalnih ganglija. Može se prepoznati po karakterističnom platou tokom faze retrakcije ciklusa, a umjetna aktivacija uzrokuje široko rasprostranjenu aktivnost faze retrakcije u mnogim bukalnim neuronima (25). B9 je motoneuron faze retrakcije koji se nalazi u bukalnim ganglijima. CGC su veliki, serotonergični interneuroni koji se nalaze u cerebralnim ganglijama, koji se mogu identificirati po njihovoj veličini, lokaciji i tonik-spiking aktivnosti (30). Da bismo identificirali prethodno nekarakteristične kandidate za članove egestivne mreže, napunili smo cerebrobukalni veziv (CBC) fluorescentnom bojom, 5(6)-karboksifluoresceinom (5-CF). Poznato je da projekcioni interneuroni imaju uticaja u pokretanju uzorkovane aktivnosti u Lymnaei (30, 31), a neuroni koji pokreću egestiju identifikovani su u bukalnim ganglijima (16). Zatrpavanje CBC-a otkrilo je populaciju interneurona bukalne projekcije koje smo mogli ponovo identificirati u drugim preparatima i elektrofiziološki testirati. Neuroni od interesa su nabijeni na kolac i snimljeni neuronima sličnim komandama gutanja i egescije.

Analiza i klasifikacija in vitro ciklusa

Aktivnost na B11 je mjerena u odnosu na početak faze retrakcije, što je određeno N2v platoom ili velikom ekscitacijom na interneuronu B9 faze retrakcije. Da bi se analizirala relativna aktivnost B11 u ciklusu, ona je izmjerena 4 s prije i 4 s nakon početka faze retrakcije. Broj skokova B11 nakon početka faze povlačenja oduzet je od broja skokova B11 prije početka faze povlačenja, a zatim podijeljen s ukupnim brojem skokova u periodu 8- da bi se dobio normalizirani rezultat razlike. Koristeći ovaj rezultat, pozitivna vrijednost predstavlja više aktivnosti koja se javlja prije početka faze retrakcije i stoga se klasificira kao ciklus egescije. Negativan rezultat predstavlja veću aktivnost koja se javlja nakon početka faze retrakcije i stoga je klasifikovana kao ciklus gutanja. Da bi se uporedili efekti snažnog treninga na fiktivne cikluse hranjenja in vitro, analizirano je prvih 10 spontanih ciklusa iz 19 naivnih i 19 obučenih preparata. Kako bi se izmjerilo kako trening mijenja stabilnost izraza ciklusa, analizirani su parovi uzastopnih ciklusa. Stabilni par ciklusa je klasifikovan kao dva ista uzastopna ciklusa (ingest-ingest ili egest-egest).

Par ciklusa prebacivanja je klasifikovan kao dva različita uzastopna ciklusa (ingest-egest ili egest ingest). Vjerovatnoće prijelaza su tada izračunate brojanjem broja ciklusa prebacivanja izraženog kao razlomak ukupnog broja parova ciklusa. Da bismo testirali da li vitalni trening mijenja reakciju preparata na znakove apetita, stimulirali smo glavni kemosenzorni put, MLN (28), koji može pokretati vitalno fiktivno hranjenje (29). MLN je stimuliran korištenjem staklene usisne elektrode sa dvofaznim impulsima od 4 V sa trajanjem 0.5-ms na 1 Hz tokom 120 s. Broj fiktivnog ciklusa hranjenja ∆ izračunat je evidentiranjem aktivnosti u hranjenju motoneurona, kao što je B9, brojeći broj ciklusa koji su se desili u periodu 120- koji je prethodio MLN stimulaciji, i oduzimanjem ovog broja ciklusa kao odgovor na MLN stimulacija. CGC aktivnost je mjerena za 120 s prije i 120 s tokom MLN stimulacije. Da bi se in vitro izazvala egestija vođena senzorima, na jednjak je primijenjen taktilni stimulans 1-, koji aktivira mehanosenzorne neurone koji signaliziraju averzivne znakove mreži za hranjenje kao odgovor na prekomjerno proširenje crijeva zbog nejestivog predmeta koji se nalazi u jednjak (16). Taktilni stimulus je primijenjen pomoću mehaničke sonde kontrolirane tranzistor-tranzistor logičkim impulsom iz mikro 1401 Mk II (CED).

Jonoforetsko punjenje neurona bojom

Following procedures previously described in (16), we filled target neurons with a fluorescent dye (5-CF) using a microelectrode. This was achieved iontophoretically using a pulse generator to apply regular interval negative square current pulses into the neuron for >30 min. Preparati su zatim ostavljeni preko noći na 4 stepena. Slike neurona su snimljene digitalnom kamerom (Andor Ixon electron-multipling charge-coupled device) postavljenom na Leica stereomikroskopu.

Primjena blokatora D2 receptora in vitro i in vivo

Sulpirid je efikasan antagonist dopamina u Lymnaei, blokirajući efekte dopaminergičkih interneurona na neurone sljedbenika, kao i fokalnu primjenu dopamina (16, 54). Da bi se testirao efekat sulpirida (±) (Sigma-Aldrich) na PRN → PS1 vezu, preparati su prvo okupani u HiDi fiziološkom rastvoru (vidi gore). Početne EPSP amplitude su zabilježene prije nego što je 10-4 M sulpirida u HiDi fiziološkom rastvoru perfuzirano u kadu tokom 10 minuta, a zatim su ponovo zabilježene EPSP amplitude. Da bi se testirali efekti sulpirida na stvaranje ciklusa in vitro u naivnim preparatima, zabilježeno je prvih 10 spontanih ciklusa, a zatim je 10-4 M sulpirida u normalnom fiziološkom rastvoru perfuzirano na preparat. Analizirano je prvih 10 spontanih ciklusa nastalih nakon 10 minuta perfuzije. Da bi se testirali efekti sulpirida na percepciju slabog treninga i stjecanje/prisjećanje pamćenja, životinjama je ubrizgano 100 ul 10-3 M sulpirida u normalnom fiziološkom rastvoru. Ranije je pokazano da je ubrizgana koncentracija lijeka razrijeđena ~10- puta tjelesnim tekućinama životinje (55). Kontrolnim životinjama je ubrizgano samo 100 ul normalnog fiziološkog rastvora. Životinje su ostavljene 2 sata prije nego što su sprovedeni testovi ponašanja.

Analiza podataka

Podaci su analizirani pomoću paleontološke statistike (PAST verzija 4.1) (56) i izraženi kao dijagrami kišnih oblaka (57). U svim slučajevima, pojedinačne tačke su iscrtane kao tačke, a zasjenjena regija (oblak) ukazuje na ukupni oblik distribucije koji se proteže od minimalnih do maksimalnih vrijednosti. Interni okviri pokazuju medijanu (crna linija), interkvartilni raspon (prvi i treći kvartil) i srednju vrijednost (siva linija). Svako "n" predstavlja pojedinačnu životinju/preparat. Normalnost je testirana pomoću Shapiro-Wilkovog testa. Dvogrupna statistička poređenja izvršena su korištenjem dvostrane statistike t-testa (bilo uparene ili neuparene kako je navedeno u tekstu) ili Mann-Whitney testa ili Wilcoxonovog testa rangiranja za neparametarske podatke. Podaci sa više od dvije grupe prvo su analizirani korištenjem jednosmjerne analize varijanse (ANOVA) ili Kruskal-Wallis testa. Naknadna poređenja su izvršena korištenjem Tukeyjevih ili Dunnovih post hoc testova sa Bonferronijevom sekvencijalnom korekcijom. Poređenja između procenta ugriza/ciklusa klasifikovanih kao gutanje ili gutanje i broja životinja/preparata koji izvode nula ili više od nule ciklusa egescije napravljena su korišćenjem Fišerovog egzaktnog testa. Nivo značajnosti je postavljen na P < 0.05.

REFERENCE I BILJEŠKE

1. F. Mery, TJ Kawecki, Troškovi dugotrajnog pamćenja u Drosophila. Science 308, 1148 (2005).

2. P.-Y. Plaçais, T. Preat, Da bi omogućio preživljavanje u uslovima nedostatka hrane, mozak onemogućava skupo pamćenje. Science 339, 440–442 (2013).

3. AC Nobre, MG Stokes, Premembering iskustvo: Hijerarhija vremenskih skala za proaktivnu pažnju. Neuron 104, 132–146 (2019).

4. ML Rosen, CE Stern, SW Michalka, KJ Devaney, DC Somers, Doprinos kognitivne kontrolne mreže vizuelnoj pažnji vođenoj memorijom. Cereb. Cortex 26, 2059–2073 (2016).

5. MG Stokes, K. Atherton, EZ Patai, AC Nobre, Dugotrajno pamćenje priprema neuronsku aktivnost za percepciju. Proc. Natl. Akad. Sci. SAD 109, E360–E367 (2011).

6. YL Chew, Y. Tanizawa, Y. Cho, B. Zhao, AJ Yu, EL Ardiel, I. Rabinowitch, J. Bai, CH Rankin, H. Lu, I. Beets, WR Schafer, Aferentni neuropeptidni sistem prenosi mehanosenzorni signali koji izazivaju senzibilizaciju i uzbuđenje kod C. elegans. Neuron 99, 1233–1246.e6 (2018).

7. J. Felsenberg, PF Jacob, T. Walker, O. Barnstedt, AJ Edmondson-Stait, MW Pleijzier, N. Otto, P. Schlegel, N. Sharifi, E. Perisse, CS Smith, JS Lauritzen, M. Costa , G. Jefferis, DD Bock, S. Waddell, Integracija paralelnih suprotstavljenih sjećanja leži u osnovi izumiranja memorije. Cell 175, 709–722.e15 (2018).

8. J. Huang, Z. Zhang, W. Feng, Y. Zhao, A. Aldanondo, MG de Brito Sanchez, M. Paoli, A. Rolland, Z. Li, H. Nie, Y. Lin, S. Zhang , M. Giurfa, S. Su, Želja za hranom je posredovana prolaznom aktivacijom dopaminergičke signalizacije u mozgu pčele. Science 376, 508–512 (2022).

9. PF Jacob, S. Waddell, Razmaknuti trening formira komplementarna dugoročna sjećanja na suprotnu valentnost u Drosophila. Neuron 106, 977–991.e4 (2020).

10. S. Sayin, J.-F. De Backer, KP Siju, ME Wosniack, LP Lewis, L.-M. Frisch, B. Gansen, P. Schlegel, A. Edmondson-Stait, N. Sharifi, CB Fisher, SA Calle-Schuler, JS Lauritzen, DD Bock, M. Costa, GSXE Jefferis, J. Gjorgjieva, IC Grunwald Kadow, A Neuralni krug arbitrira između upornosti i povlačenja kod gladne Drosophile. Neuron 104, 544–558.e6 (2019).

11. B. Senapati, C.-H. Tsao, Y.-A. Juan, T.-H. Chiu, C.-L. Wu, S. Waddell, S. Lin, Neuralni mehanizam za ekspresiju relevantnih uspomena specifičnih za stanje lišavanja kod Drosophila. Nat. Neurosci. 22, 2029–2039 (2019).

12. K. Steck, SJ Walker, PM Itskov, C. Baltazar, JM Moreira, C. Ribeiro, Interno stanje aminokiselina modulira neurone ukusa kvasca kako bi podržao homeostazu proteina u Drosophila. eLife 7, e31625 (2018)

For more information:1950477648nn@gmail.com